目的　　对于晚期结直肠癌病人来说，全身化疗是最常用最有效的治疗手段之一，但两种常用的化疗方案——FOLFOX和FOLFIRI的疗效有限，生存期只有15个月左右。EGFR通路活化在结肠癌的发生发展中起重要作用，参与肿瘤细胞的存活、增殖、血管生成、侵袭及转移等。西妥昔单抗（Cetuximab，简称C225，商品名爱必妥@）是第一个抗EGFR单克隆抗体，可以在胞外区竞争性结合EGFR，抑制其与天然配体的结合，从而阻断了下游信号通路。临床研究证实西妥昔单抗联合化疗可有效提高晚期结直肠癌病人的疗效，延长生存。2004年，FDA批准西妥昔单抗用于结直肠癌的治疗。　　随着西妥昔单抗在临床应用增多和基础研究的深入，人们逐渐发现只有KRAS野生型结直肠癌病人应用西妥昔单抗联合化疗才能提高疗效，KRAS突变的病人应用则基本无效或收效甚微。因此，ASCO指南自2009年开始推荐西妥昔单抗只适用于KRAS野生型结直肠癌病人，KRAS突变成为指南推荐的唯一疗效预测标志物。通过KRAS基因检测可以筛选出60％左右的晚期结直肠癌病人是KRAS野生型，但是实际上，在所有KRAS野生型病人中只有60％左右应用西妥昔单抗有效，说明有40％的KRAS野生型结直肠癌病人存在着原发性耐药，而在60％对西妥昔单抗有效的病人在应用过程中也部分发生了继发性耐药，这些耐药限制了西妥昔单抗的临床应用。　　KRAS野生型对西妥昔单抗耐药的机制有很多:EGFR配体和受体过表达，EGFR泛素化，EGFR核转位，EGFR变异体Ⅲ(EGFRvⅢ)，EGFR同其它跨膜蛋白形成异源二聚体，非受体酪氨酸激酶c-Src间接活化EGFR通路，绕开EGFR通路的其它受体酪氨酸激酶受体的活化（如IGF-1R和HGF/MET通路）等。在众多耐药机制中，HGF/MET通路的替代活化和下游Src家族激酶(SFK)活化是EGFR抑制剂产生耐药的重要原因。　　HGF/MET通路促进肿瘤增殖、存活、侵袭、转移。近几年的研究发现，MET通路的活化与靶向药物（包括HER2抑制剂和EGFR抑制剂）耐药有关。有关HGF/MET通路在耐药中的作用成为研究热点，已经开展了多个针对HGF/MET通路拮抗剂和抑制剂的临床研究，具有一定的应用前景。Src家族激酶在受体介导的信号传递及细胞间通讯中具有中心调节作用，Src活化是HER2抑制剂和EGFR抑制剂耐药的共同机制。因此，本研究结合了HGF/MET通路和下游的Src因子，深入探讨了非配体依赖的MET活化在结肠癌细胞中参与西妥昔单抗耐药的机制及下游因子Src调节MET活化参与耐药的机制。　　材料与方法　　1、采用MTT法测定细胞活力，绘制细胞增殖曲线。　　2、集落形成实验观察药物作用后细胞克隆的形成。　　3、Westernblot检测信号通路相关蛋白变化:MET、EGFR、Src、Akt、ERK、PARP、Caspase-3等。　　4、免疫共沉降检测蛋白之间的相互结合。　　5、采用LipofectamineTAM2000试剂进行瞬时转染下调MET蛋白表达。　　6、免疫荧光检测细胞膜表面p-MET表达。　　7、统计学处理:每次实验重复3次，数据以均值±标准差（(x)±s）表示，两组间差异采用Studentst检验，P＜0.05有统计学意义。　　实验结果　　1、西妥昔单抗诱导了相对耐药的结肠癌细胞系Caco-2发生MET磷酸化　　通过检测8种结肠癌细胞(SW480、HCT-116、DLD-1、HT-29、RKO、Caco-2、DiFi和LIM1215)基础蛋白表达及对西妥昔单抗的敏感性，发现EGFR、MET和Src及其磷酸化水平的基础表达与对西妥昔单抗的敏感性没有明显相关性。进一步研究西妥昔单抗作用于KRAS、BRAF和PIK3CA均为野生型的Caco-2和DiFi细胞后发现，西妥昔单抗诱导了KRAS野生型细胞中对西妥昔单抗相对耐药的Caco-2细胞（西妥昔单抗10μg/ml作用72h时抑制率为15.76±2.42％）发生p-MET明显活化，而西妥昔单抗作用于相对敏感的DiFi细胞（西妥昔单抗10μg/ml作用72h时抑制率为40.68±5.46％）后可抑制p-MET表达。通过免疫荧光检测膜表面的p-MET表达，也证实了西妥昔单抗作用于Caco-2细胞48h后p-MET膜表达增强。根据这两种对西妥昔单抗敏感性不同的KRAS野生型结肠癌细胞应用西妥昔单抗后p-MET表达的差异，推测在没有配体刺激情况下发生的非配体依赖MET磷酸化参与了结肠癌细胞对西妥昔单抗的耐药。　　2、MET抑制剂PHA-665752可抑制西妥昔单抗诱导的p-MET活化，与西妥昔单抗联用促进凋亡　　应用MET抑制剂PHA-665752不仅抑制了Caco-2细胞自身的MET磷酸化，也明显抑制了西妥昔单抗诱导的p-MET活化，同西妥昔单抗联合应用促进了PARP和Caspase-3裂解。MTT结果显示，西妥昔单抗作用48h的存活率是83.49±1.46％，PHA-665752单药存活率是70.00±6.87％，两药联合的存活率是63.12±7.22％，两药联合较单用西妥昔单抗或单药PHA-665752提高了抑制率（P值分别为0.013和0.003）。集落形成实验也证实两药联合的细胞克隆数目减少。　　3、通过siRNA下调MET蛋白表达后应用西妥昔单抗可进一步抑制下游PI3K/Akt和MAPK/ERK通路，促进凋亡　　采用LipofectamineTAM2000试剂进行瞬时转染下调Caco-2细胞中MET蛋白表达，两对siRNA序列可下调MET蛋白表达约70％，同时可促进PARP裂解，下调p-Akt和p-ERK表达。在转染对照siRNA组（ScrambledsiRNA）和METsiRNA组分别加入西妥昔单抗作用48h后发现，METsiRNA组加入西妥昔单抗较对照组可进一步促进PARP裂解、下调p-Akt和p-ERK表达，说明MET通路在Caco-2细胞对西妥昔单抗的耐药机制中起到重要作用。　　4、西妥昔单抗作用Caco-2细胞48h后发生p-Src活化，而作用DiFi细胞后p-Src表达被抑制　　在西妥昔单抗作用于Caco-2细胞中，下游因子Src不断被活化，下游的p-Akt和p-ERK受到轻度抑制，而西妥昔单抗作用于DiFi细胞后p-Src被抑制，下游的p-Akt和p-ERK被明显抑制，推测Src活化也参与了Caco-2细胞对西妥昔单抗的耐药。　　5、Src抑制剂PP2和达沙替尼(dasatinib)可降低西妥昔单抗诱导的p-MET活化，抑制下游PI3K/Akt和MAPK/ERK通路，促进凋亡，增强对西妥昔单抗的敏感性　　通过应用Src抑制剂PP2和dasatinib发现，Src抑制剂可明显抑制西妥昔单抗诱导的p-MET活化，并抑制了下游PI3K/Akt和MAPK/ERK信号通路，增强了PARP和Caspase-3的裂解。西妥昔单抗与Src抑制剂联合进一步下调p-Akt，增强了凋亡作用，并提高了药物的敏感性。Src抑制剂PP2和西妥昔单抗作用48h的MTT结果显示，西妥昔单抗的存活率是84.47±4.25％，PP2单药存活率是64.42±6.14％，两药联合的存活率是56.51±7.04％，两药联合较单用西妥昔单抗或单药PP2提高了抑制率（P值分别为0.024和0.002）。Src抑制剂dasatinib和西妥昔单抗作用48h的MTT结果显示，西妥昔单抗的存活率是87.98±1.69％，dasatinib单药存活率是77.13±0.48％，两药联合的存活率是62.33±2.77％，两药联合较单用西妥昔单抗或单药dasatinib提高了抑制率（P值分别为0.001和0.005）。以上结果证实，Src活化与MET活化在西妥昔单抗的耐药中密切相关，抑制Src活化可进一步增强对西妥昔单抗的敏感性。　　6、西妥昔单抗诱导Caco-2细胞形成MET/Src/EGFR复合物　　西妥昔单抗作用于Caco-2细胞后募集了EGFR，增强了MET与Src表达，形成了MET/Src/EGFR复合物，而西妥昔单抗作用于DiFi细胞没有募集EGFR，并使MET与Src的天然结合减弱。推断MET/Src/EGFR复合物的形成可能是活化p-MET、产生对西妥昔单抗耐药的原因之一。应用MET抑制剂PHA-665752可抑制MET/Src/EGFR复合物的形成，Src抑制剂和MET抑制剂均可抑制复合物中MET和Src的磷酸化水平。　　结论　　1、非配体依赖的MET磷酸化是KRAS野生型结肠癌细胞对西妥昔单抗耐药的机制之一。　　2、MET抑制剂PHA-665752可抑制西妥昔单抗诱导Caco-2细胞发生的p-MET活化，与西妥昔单抗联用促进凋亡，增强了对西妥昔单抗的敏感性。　　3、下调MET蛋白表达后应用西妥昔单抗可进一步抑制下游PI3K/Akt和MAPK/ERK通路，并促进了凋亡。　　4、Src活化参与了Caco-2细胞对西妥昔单抗的耐药，Src活化与MET活化在西妥昔单抗耐药中密切相关。抑制Src活化可抑制西妥昔单抗诱导的p-MET活化和下游PI3K/Akt通路，促进凋亡，增强了西妥昔单抗的敏感性。　　5、西妥昔单抗作用于Caco-2细胞后募集了EGFR，增强了MET与Src表达，形成了MET/Src/EGFR复合物，可能是活化MET、对西妥昔单抗产生耐药的机制之一。应用MET抑制剂PHA-665752可抑制MET/Src/EGFR复合物的形成，Src抑制剂和MET抑制剂均可抑制复合物中MET和Src的磷酸化水平。