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研究背景太空飞行、长期卧床、久坐、肢体制动等不仅会引起肌萎缩,还会诱发骨质疏松,导致机体运动功能减退。冬眠哺乳动物在历经冬眠长期不活动状态后,肌骨仍能得以良好维持。冬眠动物独特的对抗废用性肌骨功能减退的机制已成为一大研究热点。鉴于骨骼肌蛋白代谢平衡与骨代谢平衡分别是骨骼肌与骨骼得以良好维持的关键机制,本研究假设一,冬眠期动物可能通过维持肌骨代谢平衡继而维持肌骨形态和功能。鉴于骨骼肌蛋白代谢与骨代谢受许多共调节因子的调控,本研究假设二,冬眠期动物肌骨代谢可能受一些肌骨共调节因子的调控。鉴于已有的冬眠动物骨骼肌转录组学结果提示,冬眠期肌骨正调节因子胰岛素样生长因子-1(insulin-likegrowthfactor-1,IGF-1)上调,负调节因子肌肉生长抑制素(myostatin)下调,表现出与非冬眠动物废用状态下变化相反的现象,本研究选择上述两个肌骨共调节因子,从肌骨整合研究的全新角度出发,对季节循环及冬眠-阵间觉醒循环中达乌尔黄鼠(Spermophilusdauricus)后肢肌骨形态、代谢及共调节因子相关指标的变化进行了系统的时程性研究,旨在为揭示冬眠动物运动系统的生理适应机制提供新见解。研究对象与方法以夏季活跃组、冬眠前组、冬眠组、阵间觉醒组、觉醒后再入眠组及出眠组六组达乌尔黄鼠的胫部肌骨(比目鱼肌、胫骨前肌、胫骨)和股部肌骨(股内侧肌、股外侧肌、股骨)为研究对象,采用组织冰冻切片、免疫荧光组化和激光共聚焦拍照技术对骨骼肌的肌纤维横截面积进行检测;采用微计算机断层扫描技术对骨骼的骨微观结构参数进行检测;采用三点弯曲实验技术对骨骼的力学性能指标进行检测;采用酶活性检测技术对骨骼肌中类糜蛋白酶活性进行检测;采用组织石蜡切片和苏木精-伊红染色技术对骨骼的成骨细胞分化程度进行检测;采用抗酒石酸酸性磷酸酶染色技术对骨骼的破骨细胞分化程度进行检测;采用酶联免疫吸附测定技术对骨骼肌/骨骼组织中IGF-1蛋白含量进行检测;采用免疫荧光染色技术对肌骨中IGF-1与其受体IGF-1R的共定位水平进行检测;采用蛋白质印迹法对骨骼肌蛋白合成指标包括4E-BP1、p-4E-BP1(Thr37/46)、S6K1和p-S6K1(Thr389),蛋白降解指标包括MAFbx和MuRF1,骨形成指标包括RUNX2、ALP、COL-1、OCN和OPG,骨吸收指标包括MMP9、CathepsinK和RANKL,IGF-1信号通路中关键指标包括PI3K、p-PI3K(Tyr607)、Akt、p-Akt(Thr389)、mTOR、p-mTOR(Ser2448)、FOXO1、p-FOXO1(Ser256)、GSK3β)、p-GSK3β(Ser9)、SGK-1、p-SGK-1(Thr256)、β-catenin,myostatin信号通路中关键指标包括myostatin、ActRIIB、Smad2/3、p-Smad2(Ser465/467)/3(Ser423/425)的蛋白表达水平进行检测。研究结果本研究重点关注两个方面,其一是以夏季活跃组为对照,观察动物在入眠准备阶段(冬眠前组)、冬眠期不同状态(冬眠组、阵间觉醒组和觉醒后再入眠组)以及出眠后(出眠组)相关指标的变化;其二是以冬眠组为对照,观察阵间觉醒组及觉醒后再入眠组相关指标的变化。1.不同时期达乌尔黄鼠肌骨形态指标的变化(1)与夏季活跃组或冬眠组相比,不同组骨骼肌的肌重和肌纤维横截面积均未发生显著变化。(2)与夏季活跃组相比,出眠组胫骨皮质骨厚度下降51%,骨表面积骨体积比值增加71%,骨小梁厚度下降43%,骨小梁分离度下降54%,骨小梁数目增加108%,股骨骨小梁间距增加60%。不同组骨骼的骨重、骨长、力学性能指标和多数骨微观结构参数均未发生显著变化。2.不同时期达乌尔黄鼠肌骨代谢指标的变化(1)与夏季活跃组相比,阵间觉醒组股内侧肌中p-4E-BP1/4E-BP1比值升高80%,胫骨前肌中类糜蛋白酶活性升高62%,不同组骨骼肌中p-S6K1/S6K1比值、MAFbx和MuRF1的蛋白表达水平均未发生显著变化。(2)与夏季活跃组或冬眠组相比,阵间觉醒组胫骨皮质骨成骨细胞数目分别增加110%和68%;与冬眠组相比,阵间觉醒组胫骨松质骨破骨细胞数目增加105%;与夏季活跃组相比,阵间觉醒组股骨破骨细胞表面长度/骨表面长度增加128%;不同组骨形成关键指标RUNX2,ALP,COL-1和OCN,骨吸收关键指标MMP9,CathepsinK的蛋白表达水平和OPG/RANKL比值未发生显著变化。3.不同时期肌骨共调节相关指标的变化(1)与夏季活跃组相比,冬眠前组和阵间觉醒组IGF-1及其受体IGF-1R的皮尔逊相关系数分别升高50%和35%;与夏季活跃组相比,阵间觉醒组和觉醒后再入眠组p-SGK-1/SGK-1比值分别升高54%和62%,不同组IGF-1的蛋白含量、p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR、p-FOXO1/FOXO1和p-GSK3β/GSK3β比值均未发生显著变化。(2)与夏季活跃组相比,觉醒后再入眠组股骨中β-catenin的蛋白表达水平升高84%,不同组股骨中IGF-1蛋白含量、IGF-1和IGF-1R的皮尔逊相关系数、p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt和p-GSK3β/GSK3β比值均未发生显著变化。(3)与夏季活跃组相比,觉醒后再入眠组股内侧肌中myostatin的蛋白表达水平降低70%,不同组ActRIIB的蛋白表达水平和Smad2/3/p-Smad2/3比值均未发生显著变化。(4)与夏季活跃组相比,冬眠组和觉醒后再入眠组股骨中p-Smad2/3/Smad2/3比值分别降低58%和53%,不同组ActRIIB的蛋白表达水平未发生显著变化。研究结论季节循环中与夏季活跃组相比,以及冬眠-阵间觉醒循环中与冬眠组相比,不同组达乌尔黄鼠后肢肌骨形态指标多数维持稳定,仅出眠组少数骨微观结构参数出现退行性变化,且胫骨出现骨小梁丢失的同时伴随着骨小梁生成现象;不同组达乌尔黄鼠后肢肌骨代谢指标中多数未发生显著变化,少数在阵间觉醒期上调;不同组肌骨正性共调节因子IGF-1及其下游信号通路中多数指标稳定表达,少数在阵间觉醒或觉醒后再入眠时上调,肌骨负性共调节因子myostatin及其下游信号通路中多数指标稳定表达,少数在阵间觉醒或觉醒后再入眠时下调。