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类固醇激素的稳态是维持动物机体正常生命活动的保障。肾上腺是类固醇激素的主要合成场所,而肝脏则是主要的代谢部位。3p-羟类固醇脱氢酶/△5-Δ4-异构酶(3β-hydroxysteroid dehydrogenase/A5-A4 isomerase,3β-HSD)在类固醇激素的生物合成和降解中发挥重要作用。研究发现,3β-HSD功能的丧失将阻断肾上腺和性腺糖皮质激素、盐皮质激素和性激素的生成,肝脏类固醇激素的代谢也受到抑制。3β-HSD的表达及活性受多种因素的影响,包括类固醇激素对其反馈作用及各种转录因子的调控,然而这些研究主要集中在人的肾上腺细胞系,猪3β-HSD表达调控的研究还很少。因此,本研究的目的是探索雄性断奶仔猪和出栏猪肾上腺和肝脏3β-HSD基因表达的品种和性别差异及其分子调控机制。1雄性断奶仔猪肾上腺3β-HSD基因表达的品种差异选取25日龄的雄性断奶大白猪5头,二花脸猪6头,屠宰,收集血清,采集肾上腺样品,比较两品种猪肾上腺3β-HSD的表达,探讨品种差异表达的转录调控机制。结果显示,二花脸猪血清皮质醇(P<0.01)和睾酮(P<0.01)水平均显著高于大白猪；二花脸猪肾上腺3β-HSD mRNA(P<0.01)和蛋白(P<0.05)表达水平也显著高于大白猪；比较两品种猪3β-HSD基因的5’-侧翼序列,发现大白猪3β-HSD基因启动子区含9个TTAT的短串联重复序列,二花脸猪仅含8个重复,另外两品种猪还存在3个单核苷酸多态性位点(single nucleotide polymorphisms, SNPs)勺差异,这种序列的差异导致二花脸猪3β-HSD基因启动子活性强于大白猪(P<0.05)；检测可能调控3β-HSD表达的转录因子的表达情况,发现二花脸猪肾上腺CCAAT增强子结合蛋白β(CCAAT/enhancer binding proteinβ, C/EBPβ)的mRNA(P<0.05)和蛋白(P<0.05)水平均显著高于大白猪,雄激素受体(androgen receptor, AR)的mRNA(P=0.06)表达水平有升高的趋势,蛋白(P<0.05)表达显著高于大白猪,而糖皮质激素受体(glucocorticoid receptor, GR)的mRNA(P<0.05)和蛋白(P<0.05)表达水平显著低于大白猪；染色质免疫共沉淀(Chromatin immunoprecipitation, ChIP)研究发现,二花脸猪肾上腺3β-HSD基因启动子区C/EBPβ的结合水平(P<0.05)及组蛋白乙酰化(H3Ac)水平(P<0.05)均显著高于大白猪；免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation, Co-IP)显示,两品种猪。肾上腺GR和AR都可与C/EBPβ结合。以上结果提示,雄性断奶仔猪肾上腺3p-HSD基因表达的品种差异可能是由3p-HSD基因启动子区C/EBPβ结合水平的不同引起的,3β-HSD基因启动子区序列的差异及GR/AR与C/EBPβ间蛋白-蛋白的互作可能也参与其中。2雄性断奶仔猪肝脏3β-HSD基因表达的品种差异肝脏3β-HSD在类固醇激素的代谢失活中起重要作用,然而调控猪肝脏3β-HSD品种差异表达的分子机制尚不清楚。在本研究中我们比较了25日龄雄性断奶大白猪和二花脸猪肝脏3p-HSD的表达,并探索可能影响品种差异表达的转录调控机制。结果显示,二花脸猪肝脏3β-HSD mRNA表达水平极显著低于大白猪(P<0.01),与血清皮质醇和睾酮水平呈负相关；对两品种猪3β-HSD基因启动子序列进行截短,比较不同片段的启动子活性,发现当3p-HSD基因启动子片段含TTAT重复序列时(-588 bp-+156 bp),二花脸猪3p-HSD启动子活性大于大白猪(P<0.01),但当截短至仅含一个SNP时(-341 bp-+156 bp),二花脸猪3p-HSD启动子活性极显著低于大白猪(P<0.01)；二花脸猪肝脏AR(P=0.07)和C/EBPβ (P< 0.05)的mRNA表达水平显著低于大白猪,而GRmRNA(P<0.05)表达水平及AR(P<0.05)、GR(Jp<0.0I)和磷酸化的GR(Ser2¨)(P<0.01)的蛋白表达水平均显著高于大白猪；ChIP研究发现,二花脸猪肝脏3p-HSD启动子区GR的结合水平显著低于大白猪(P<0.05),而AR知C/EBPβ在两品种猪无差异；Co-IP未发现GR、AR可以和C/EBPβ结合。以上结果提示,雄性断奶仔猪肝脏3p-HSD基因表达的品种差异可能是由3p-HSD基因启动子区GR结合水平的不同引起的,两品种猪3p-HSD近端核心启动子部分的SNP可能也是造成品种差异表达的原因之一3出栏猪肾上腺3p-HSD基因表达的性别差异选取28头杜长大三元杂交仔猪,分为三组,其中8头雄性仔猪和10头雌性仔猪不做任何处理,另10头雄性仔猪在出生1周时手术去势,22天断奶,标准日粮饲喂,直至出栏,屠宰采集样品。结果显示,出栏时公猪血清睾酮水平极显著高于去势公猪和母猪(P<0.01),而母猪雌二醇水平极显著高于公猪和去势公猪(P<0.01)；公猪和去势公猪肾上腺3β-HSD mRNA表达水平显著低于母猪(P<0.05),但蛋白表达无差异；对转录调控因子的研究发现,公猪AR(P<0.05)和GR(P<0.05)mRNA表达水平显著低于母猪,而蛋白表达仅C/EBPβ显著低于母猪(P<0.05)；ChIP结果显示,母猪3p-HSD基因启动子区C/EBPβ的结合水平均显著高于公猪和去势公猪(P<0.05)；Co-IP未发现C/EBPβ可以和AR结合。以上结果提示,C/EBPβ可能参与调控了出栏猪肾上腺3β-HSD的性别差异表达。4出栏猪肝脏3β-HSD基因表达的性别差异以往研究已表明,猪肝脏3β-HSD的表达存在性别差异,然而形成这种差异的分子机制并不清楚。因此我们选用不同性别的出栏猪作为研究对象,探讨猪肝脏3β-HSD表达性别差异的分子调控机制。结果显示,公猪3β-HSD mRNA(P<0.05)和蛋白表达(P<0.05)水平均显著低于去势公猪和母猪；对调控3β-HSD的转录因子的研究发现,公猪肝脏ARmRNA表达水平显著低于去势公猪和母猪(P<0.05),而C/EBPβ mRNA显著高于去势公猪和母猪(P<0.05),检测转录因子的蛋白表达发现,公猪AR蛋白表达显著低于去势公猪和母猪(P<0.05),公猪C/EBPβ的蛋白表达水平显著低于去势公猪(P<0.05),与母猪无差异；ChIP分析发现,公猪3β-HSD基因启动子区GR的结合水平显著高于去势公猪和母猪(P<0.05),另外公猪3β-HSD基因启动子区H3Ac水平显著低于去势公猪和母猪(P<0.05)；Co-IP未检测到GR可以结合AR。以上结果提示,3β-HSD基因启动子区GR的结合水平及组蛋白H3乙酰化水平对出栏猪肝脏3β-HSD表达的性别差异起重要的调控作用。