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目的研究热处理肾癌细胞后制备的冻融抗原负载树突状细胞(DC)体外诱导、活化细胞毒性T细胞(CTL)特异性杀伤肾癌细胞的效应及其机制,为晚期肾癌的治疗提供一种简便有效的新途径。方法1、肾癌细胞的体外培养786-0肾癌细胞株常规传代培养,收集对数生长期细胞以备实验。2、树突状细胞的培养、形态学鉴定及免疫标志检测(1)利用密度梯度离心法从健康人外周血中分离出单个核细胞(PBMC),短暂培养后的贴壁细胞应用GM-CSF、IL-4联合诱导培养4天,第5天加入TNF-α。(2)热应激和反复冻融786-0肾癌细胞制备热休克肿瘤细胞冻融抗原,在第6天加入至培养瓶中得到的DC记为HSAg-DC组;反复冻融786-0肾癌细胞制备单纯肿瘤细胞冻融抗原,在第6天加入至培养瓶中得到的DC记为Ag-DC组;在第6天只加入PBS而得到的DC记为non-DC组。(3) DC培养的第2天、第5-6天、第7-8天应用光镜对DC进行形态学鉴定;DC培养的第3-4天、第7-8天应用扫描电镜对DC进行形态学鉴定。(4) DC培养的第7-8天用流式细胞仪(FCM)测定HSAg-DC组和Ag-DC组CDla、CD83、CD80、CD86、四种表面分子的阳性表达率。3、T淋巴细胞的培养及混合淋巴细胞反应(1)将PBMC短暂培养后的悬浮细胞通过尼龙毛柱法获得T淋巴细胞,加入IL-2培养至T淋巴细胞成熟。(2)将培养至第8天的3组DC与T细胞按20:1的效靶比混合培养,获得三组CTL,分别记为HSAg-DC-CTL组、Ag-DC-CTL组、non-DC-CTL组。4、细胞毒实验及CTL杀伤活性测定将3组CTL与肾癌细胞以不同的效靶比(10:1、20:1、50:1)混合培养后应用MTT法测定各反应孔的吸光值,通过公式计算出3组CTL对肾癌细胞的杀伤率。结果1、DC的形态学鉴定联合应用GM-CSF、IL-4、TNF-α和肿瘤抗原可以诱导DC成熟,光镜和扫描电镜观察结果显示,加入TNF-α和肿瘤抗原后DC体积变大,表面粗糙,突起更加明显,呈典型的树突状,具有成熟DC的特征。2、DC表面标志的检测培养第7-8天时应用FCM分析DC表面CDla、CD83、CD80、CD86的阳性表达率,结果显示,HSAg-DC组的阳性表达率均高于Ag-DC组,其中CDla、CD83、CD86的表达差异有显著性意义(P＜0.05)。3、CTL对肾癌细胞的杀伤效应检测各组DC诱导产生的CTL均对肾癌细胞产生杀伤作用,各组杀伤率随效靶比的增高而增强;同一效靶比时HSAg-DC-CTL组杀伤效应最强,Ag-DC-CTL组次之,non-DC-CTL组最弱,经统计学分析,各组间杀伤率的差异均有显著性意义(P＜0.05)。结论(1)光镜、电镜观察及FCM分析结果表明联合应用TNF-α和肾癌抗原可诱导DC成熟。(2) DC表面标志检测结果提示热处理肾癌细胞制备的冻融抗原负载DC后可以明显增强DC的抗原递呈能力。(3) MTT法检测CTL杀伤活性结果显示热处理肾癌细胞制备的冻融抗原负载DC后能诱导强大杀伤力的肿瘤特异性CTL。(4)本研究提示,热休克肾癌冻融抗原负载的DC瘤苗具有强大的抗肿瘤免疫效应,可以为晚期肾癌的治疗提供一种简便有效的新途径。