论文部分内容阅读
ACE2(angiotensin-converting enzyme 2)是肾素-血管紧张素系统(renin-angiotensinsystem,RAS)的新成员,且在肠道中分布广泛。近期的研究发现,AC E2在大鼠和小鼠体内均与肠道中性氨基酸运输起到协同作用。色氨酸在玉米-豆粕型饲粮中为主要的限制性氨基酸,虽然含量少但是却发挥重要的代谢作用。目前对猪肠道色氨酸吸收的营养调控机制还研究较少,所以本试验以肠道上皮细胞IPEC-J2为研究对象,来深入解析ACE2介导猪肠上皮细胞增殖及色氨酸转运相关通路的研究。试验分为两部分:第一部分不同色氨酸浓度(0.044 mmol/L(即对照组)、0.1 mmol/L、0.2 mmol/L、0.4 mmol/L、0.8 mmol/L、1.6 mmol/L)处理细胞,采用细胞计数方法和Cell Counting K it-8法检测细胞数量和细胞活力,采用RT-PCR和Western blotting检测ACE2、B0AT1基因和蛋白质的表达水平,用HPLC检测培养基上清中游离色氨酸浓度。第二部分采用ACE2基因过表达和ACE2基因RNA干扰手段,通过RT-PCR和Western blot技术测定B0AT1、Ah R、ERK1/2、m TOR及下游通路中S6K1、4EBP1基因和蛋白质表达变化,HPLC检测培养基上清中游离氨基酸浓度变化。分析ACE2对IPEC-J2细胞中色氨酸转运的影响。结果如下:(1)不同浓度色氨酸处理IPEC-J2细胞48h后,细胞形态变化方面:对照组、0.1mmol/L的L-Trp组、0.2 mmol/L的L-Trp处理组的细胞形态是正常的,0.4 mmol/L的L-Trp处理组的细胞开始出现死亡,0.8、1.6 mmol/L L-Trp处理组的细胞大量脱落死亡;细胞数目和细胞活力方面:与对照组相比,0.1、0.2 mmol/L的L-Trp处理组均差异不显著(P>0.05),0.4、0.8、1.6 mmol/L的L-Trp处理组均差异显著降低(P<0.05)。(2)随着培养基中色氨酸浓度的升高,进入细胞中的色氨酸浓度也升高。细胞中色氨酸浓度升高会提高ACE2 m RNA和蛋白质的表达,同时也会提高中性氨基酸转运载体B0AT1的m RNA相对表达丰度和蛋白质的表达,当细胞培养基色氨酸浓度达到0.4mmol/L时,ACE2和B0AT1 m RNA相对表达丰度均显著高于其他组(P<0.05),但是ACE2和B0AT1蛋白质表达水平变化不一致,当细胞培养基色氨酸浓度达到0.4mmol/L时,AC E2蛋白质表达最高,而B0AT1蛋白质表达水平在0.2 mmol/L L-Trp处理组时最高。(3)首次成功构建了猪真核绿色荧光蛋白质表达载体p EGFP-C3/ACE2。(4)ACE2过表达可以显著提高B0AT1基因和蛋白质表达且可以显著上调m TOR信号通路关键蛋白质的表达水平;促进细胞增殖;显著提高Ah R m RNA相对表达丰度和蛋白质表达;显著下调ERK1/2的蛋白质磷酸化(P<0.05)。ACE2表达升高,提高色氨酸、丝氨酸、甘氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、缬氨酸、亮氨酸的转运,其中大部分是中性氨基酸。(5)ACE2 RNA干扰后可以显著降低B0AT1基因和蛋白质表达且可以显著下调m TOR信号通路关键蛋白质的表达水平;显著降低Ah R m RNA相对表达丰度和蛋白质表达;显著上调ERK1/2的蛋白质磷酸化(P<0.05)。ACE2表达降低,降低色氨酸、甘氨酸、组氨酸和谷氨酸转运。综上所述,猪ACE2通过B0AT1共同调节肠上皮细胞IPEC-J2中色氨酸的转运并会激活m TOR信号通路及其下游蛋白质S6K1和4EBP1磷酸化,且会促进细胞增殖。同时发现猪ACE2介导肠上皮细胞IPEC-J2中色氨酸的转运的同时会调节Ah R转录因子的表达和ERK1/2蛋白质的磷酸化。