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背景肺癌是全球癌症患者死亡的主要原因之一,根据不同的组织学特征,肺癌分为非小细胞肺癌（Non-Small Cell Lung Cancer,NSCLC）和小细胞肺癌（Small Cell Lung Cancer,SCLC）两大类,分别约占肺癌总数的85%和15%左右,其中腺癌（Lung Adenocarcinoma,LUAD）约占非小细胞肺癌的50%。近年来,尽管随着计算机断层扫描、支气管镜、痰细胞学等多种诊断技术,以及手术切除、放疗、化疗等主要治疗手段的改进,但肺癌患者的预后仍不理想,其中主要原因之一便是肿瘤的转移。因此,探讨影响肺癌侵袭和转移的关键因素和分子机制对肺癌的诊断和治疗具有重要意义。microRNA（mi RNA）是一种单链非编码小RNA,通过抑制靶基因翻译或诱导其降解,在转录后水平调控靶基因的表达。mi RNA的异常表达在癌症的发生和发展过程中已被广泛认知,因此,miRNA有望成为肺癌诊断和预后的标志物,以及潜在的治疗靶点。据报道,miR-198-5p在多种恶性肿瘤中表达下调,而且miR-198-5p能够通过作用于一些靶基因抑制非小细胞肺癌细胞的增殖并促进细胞凋亡。然而,miR-198-5p在肺腺癌迁移和侵袭中的作用及可能涉及的分子机制尚不清楚。岩藻糖基化涉及细胞生长、粘附和肿瘤转移等多种生理和病理过程。岩藻糖基转移酶8（Fucosyltransferase 8,FUT8）在正常状态下表达稳定,但有研究发现FUT8在包括肺癌等一些恶性肿瘤组织中表达或活性明显上调,并且下调FUT8能够显著抑制肺癌细胞增殖侵袭等恶性行为,其高表达也与患者的不良预后相关。目的1.检测miR-198-5p在肺腺癌组织中的表达水平并分析其及与患者临床病理类型的关系。2.研究miR-198-5p对肺腺癌细胞侵袭迁移和EMT的作用。3.探讨miR-198-5p参与影响肺腺癌细胞侵袭迁移和EMT的分子机制。方法第一部分:miR-198-5p和FUT8在肺腺癌组织中的表达及相关性1.通过实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR,qRT-PCR）检测肺腺癌肿瘤组织和相应癌旁正常组织中miR-198-5p的表达水平。2.分析miR-198-5p和肺癌患者临床病理特征的相关性。3.通过靶基因预测软件预测出miR-198-5p可能的靶基因。4.qRT-PCR检测FUT8在肿瘤组织和配对癌旁正常组织中的表达水平,并分析其与miR-198-5p的相关性。第二部分:miR-198-5p对肺腺癌细胞侵袭迁移和EMT的影响1.qRT-PCR检测A549、HCC827、NCI-H1650、NCI-H1299四种肺腺癌细胞系中miR-198-5p的表达水平。选取表达量最高的A549细胞和最低的NCI-H1650细胞进行后续实验。2.将miR-198-5p mimic和miR-198-5p inhibitor分别转染至NCI-H1650细胞和A549细胞48小时后,qRT-PCR检测转染后两种细胞中miR-198-5p的m RNA表达含量。3.划痕实验检测转染后各组细胞迁移能力的变化。4.Transwell小室实验检测转染后各组细胞侵袭能力的变化。5.构建裸鼠尾静脉转移瘤模型,检测过表达miR-198-5p后对肺腺癌细胞体内转移能力的影响。6.Western Blot检测转染后各组细胞EMT标志蛋白E-cadherin、N-cadherin、Vimentin的表达水平,免疫荧光法检测Vimentin表达变化。第三部分:miR-198-5p靶向FUT8抑制肺腺癌细胞的侵袭迁移和EMT机制的研究1.双荧光素酶报告基因实验验证FUT8是否是mi R-198-5p的靶基因。2.qRT-PCR和Western Blot检测转染miR-198-5p mimic或inhibitor后FUT8表达水平的变化。3.检测mi R-198-5p和/或FUT8过表达后对细胞侵袭迁移能力的影响,以及EMT和PI3K/AKT通路相关蛋白表达变化。结果第一部分:miR-198-5p和FUT8在肺腺癌组织中的表达及相关性1.qRT-PCR结果显示:在所有20例患者中,miR-198-5p在肿瘤组织中的表达含量低于相应癌旁正常组织,差异具有统计学意义（p<0.05）。2.miR-198-5p表达与淋巴结转移和TNM分期相关（p<0.05）。3.通过软件预测FUT8是miR-198-5p的靶基因之一。qRT-PCR结果表明FUT8在肿瘤组织中的表达含量高于相应癌旁正常组织,差异具有统计学意义（p<0.05）。4.miR-198-5p和FUT8在肿瘤组织的表达水平具有负相关性。第二部分:miR-198-5p对肺腺癌细胞侵袭迁移和EMT的影响1.利用miR-198-5p mimic和miR-198-5p inhibitor分别转染NCI-H1650细胞和A549细胞48小时后,qRT-PCR检测转染后两种细胞中miR-198-5p的m RNA表达含量的变化。结果显示,转染miR-198-5p mimic的NCI-H1650细胞miR-198-5p表达升高（p<0.01）。转染mi R-198-5p inhibitor的A549细胞miR-198-5p表达明显降低（p<0.01）。2.划痕实验检测迁移能力。NCI-H1650细胞转染miR-198-5p mimic后细胞划痕修复能力降低（p<0.05）;而A549细胞转染miR-198-5p inhibitor后细胞划痕修复能力提高（p<0.01）。3.Transwell小室实验检测侵袭能力。NCI-H1650转染mi R-198-5p mimic后细胞侵袭能力降低,穿膜细胞个数显著减少（p<0.01）;而A549转染miR-198-5p inhibitor后细胞侵袭能力升高,穿膜细胞个数显著增加（p<0.01）。4.体内实验证实,过表达miR-198-5p能够抑制肺腺癌细胞NCI-H1650的转移能力。5.Western Blot检测EMT相关蛋白的表达情况。NCI-H1650转染miR-198-5p mimic后,E-cadherin蛋白表达量显著升高（p<0.01）,N-cadherin蛋白和Vimentin蛋白表达量显著降低（p<0.01）;A549转染miR-198-5p inhibitor后,E-cadherin蛋白表达量显著降低（p<0.01）,N-cadherin蛋白和Vimentin蛋白表达量显著升高（p<0.01）。6.免疫荧光检测Vimentin表达变化,结果显示:在NCI-H1650细胞中,Control组和NC组中,Vimentin有明显的表达,而miR-198-5p mimic组中Vimentin表达量显著降低。相反,在A549细胞中,Control和NC组中Vimentin有弱表达,而miR-198-5p inhibitor组Vimentin表达显著升高。第三部分:miR-198-5p靶向FUT8抑制肺腺癌细胞的侵袭迁移和EMT机制的研究1.双荧光素酶报告基因实验验证miR-198-5p与FUT8之间的靶向关系。共转染FUT8-3’-UTR-wt与mi R-198-5p mimic组相比对照组的荧光素酶活性明显下降（p<0.01）,证实二者的靶向关系。2.miR-198-5p对FUT8表达的调控。NCI-H1650细胞中转染mi R-198-5p mimic后,FUT8 m RNA和蛋白的表达量较NC组均显著减少（p<0.01）;A549细胞转染miR-198-5p inhibitor后,FUT8 m RNA和蛋白的表达量均显著增加（p<0.01）。3.将miR-198-5p mimic和FUT8过表达质粒共转染入NCI-H1650细胞。与单独转染miR-198-5p mimic组相比,miR-198-5p mimic+FUT8组细胞的迁移率和穿膜数量明显升高（p<0.05）;上皮标志物E-cadherin蛋白表达量显著降低,而间充质标志物N-cadherin和Vimentin蛋白表达量显著升高（p<0.05）。4.Western Blot检测PI3K/AKT通路相关蛋白表达水平变化,结果表明:过表达FUT8逆转了miR-198-5p对PI3K/AKT通路的抑制作用。结论1.miR-198-5p在肺腺癌组织中低表达,其表达水平与淋巴结转移和TNM分期相关。FUT8在肺腺癌组织中高表达,miR-198-5p和FUT8在肺腺癌组织中表达负相关。2.miR-198-5p通过靶向FUT8阻断PI3K/AKT信号通路,抑制肺腺癌细胞的EMT的进程,从而影响肿瘤细胞的侵袭迁移能力。