维生素B₁₂(VB₁₂)又称钴胺素,应用范围十分广泛,由于化学合成复杂、效率低,市场上的维生素B₁₂都是通过微生物发酵的方法得到的。因此,获得高产维生素B₁₂的菌株显得尤为重要。脱氮假单胞菌的生长速率和维生素B₁₂的产量方面都表现较好,是目前研究和应用最广泛的维生素B₁₂工业生产菌。通过代谢工程提高维生素B₁₂产量的策略的研究有很多,但是脱氮假单胞菌启动子筛选方面的研究很少。启动子筛选是平衡代谢流、提高目的产物产量的重要代谢工程工具。传统原核生物常用的启动子筛选和克隆方法有:依赖于探针质粒载体筛选法,PCR克隆法。上述两种研究方法能够在一定条件下取得较好结果,但也都存在一定的局限性。近年兴起的RNA-Seq技术使启动子的筛选范围和准确率都大大提高,是基因组范围内筛选梯度强度启动子的良好方法。本论文对维生素B₁₂工业生产菌株PD320进行了 250 mL和500 mL摇瓶发酵培养,收集发酵过程中72 h和96 h共4个点的菌体进行转录组测序（RNA-Seq）,得到全基因组范围内的表征基因表达水平的RPKM值。以gfp绿色荧光蛋白基因为报告基因,启动子P.E.coli-tufA、P.E.coli-turB与Ptuf的强调通过荧光值来测定。结果显示,PD320/pBBR122-Ptuf-gfp的RFU值显著高于其他两株重组菌PD320/pBBR122-PtttfA-gfp和PD320/pBBR1 22-PtufB-gfp。说明Ptuf的强度高于其他两个启动子。选取P.denitrifican自身来源的tuf基因为参考基因,基于RPKM值挑选强、中、弱三种梯度强度的启动子,以gfp为报告基因构建启动子强度荧光检测重组菌,检测荧光值结果表明选取的启动子片段都有启动强度。接着挑选三种强度的启动子分别构建RCcobA2过表达重组菌并摇瓶发酵,结果表明PD320/pBBR122-PⅣ-RCcobA2的维生素B₁₂产量（124.09 mg/L）比 PD320/pBBR122-PⅦ-RCcobA2（110.16 mg/L）、PD320/pBBR122-PⅠ-RCcobA2（96.2 mg/L）和对照菌 PD320/pBBR122（91.72 mg/L）分别提高了 12.6%、29%和 35%。以上实验说明RNA-Seq技术筛选启动子的范围和准确率都较高,该实验为启动子强度评价和应用奠定了一定基础。实验中得到的一系列梯度强度启动子对P.denitrificans自身启动子的特性有了进一步阐释,对合成生物学中实现基因表达的精确调控和代谢产物产量提高有一定促进作用。