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目的： 乙型肝炎病毒（HBV）慢性感染是导致原发性肝细胞癌发生的重要因素之一。HBV编码17KD的多功能蛋白命名为x蛋白或HBxAg，为病毒基因组转录所需，并被认为与慢性HBV感染者发展为原发性肝细胞癌（HCC）密切相关。但其具体的作用机制尤其在HCC形成和发展过程中对肝细胞生长的影响及其分子机制仍未完全阐明。p53是一个重要的肿瘤抑制基因，p53介导的细胞信号传导通路途径在调节细胞正常生命活动中起重要作用。目前研究表明，在一些HBV感染相关的肝细胞癌中发现HBx能与p53蛋白结合，导致p53蛋白在细胞内积聚，但目前HBx在p53依赖性及非依赖性的细胞生长中的影响及作用机制仍不完全清楚。本研究主要通过观察HBx对肝癌细胞生长的影响及其对p53及p53上下游基因p21WAF1及p14ARF的作用，探讨HBx在依赖性及非依赖性p53凋亡通路中的作用靶点，对进一步阐明肝细胞癌的发生机制具有理论意义。 方法： 1、用HBx及HBx3’-40（去除羧基末端40个氨基酸）转染肝癌细胞SMMC-7721，用流式细胞仪分析检测对细胞凋亡的影响，并用氯霉素乙酰转移酶（CAT）-ELISA方法检测HBx的反式激活作用，以及绘制细胞生长曲线、平板克隆形成试验、裸鼠成瘤试验观察HBx及HBX3’-40对SMMC-7721细胞生长的影响。并用Western免疫印迹方法观察不同肝癌细胞株的p14ARF、MDM2、p53、p21WAF1蛋白的表达水平。第二军医大学博士学位论文中文摘耍 2、通过构建正、反义野生型p53与HBx、HBx3，40共转染SMMC一7721细胞及将HBx转染入不同p”状态的肝疮细胞株，来观察细胞凋亡、细胞周期、含P53结合位点PZ lwAF，启动子荧光素醉活性并用westem免疫印迹方法比较p53、PZ IWAF，表达水平的变化，分析HBx对p53及下游基因pZlwAF，的影响及其与肝疮细胞生长影响之间的关系. 3、将HBx及P14ARF单转染及共转染含野生型p53但不表达p14ARF的肝痛细胞株HepGZ，通过比较细胞凋亡、细胞周期、含p53结合位点pZIWAF‘启动子荧光素酶活性，并用westem免疫印迹方法比较P14ARF、MDMZ、P53、P21wAF‘表达水平的变化进一步分析HBx有否通过p14ARF途径影响肝癌细胞生长。结果: 1、肝癌细胞株SMMC一7721转染了1侣x及HBxs.、。后，对DNA损伤所致的细胞凋亡的歌感性增加，但HBx3，二组细胞凋亡率较1侣x减少，而且HBx的反式激活能力又较HBx3，40组强，进一步研究发现HBx及HBx3，二的细胞生长速度明显较空载体增快，同时，平板克隆形成试验及裸鼠成瘤试验，发现HBx及HBx3，二克隆形成率及致瘤性明显升高，且肿瘤细胞的PCNA表达率也明显增强，尤以HBx3’4。组的表达更为明显，这表明HBx在肝癌细胞发生过程中的作用机制可能与其促进癌细胞的恶性转化及COOH末端的突变有关，而HBx对凋亡的歌感性增加可能与其反式激活能力及与p53的结合有关. 2、HBx、HBx3’40与正义、反义野生型P53单转染及共转染SMMc一7721细胞，发现HBx及HBx3，4。均能抵制野生型p”诱导的凋亡，表明HBx对p53诱导凋亡的抑制作用可能通过不依赖p53的结合途径，同时，将HBx转入含不同P53状态的肝癌细胞，发现HBx可导致p53的表达增加，进一步研究发现HBx能够直接抑制pZlwAF，启动子荧光素的活性，因此，HBx对pZI娜‘和细胞周期的影响可能是通过非依赖p53途径而直接抑制PZ lwAF’启动子转录活性，以及通过依赖p53的途径导致p53蛋白在细胞内积乳激活P21wAF‘启动子转录活性，这两方面相互影响的结果，提出HBx对p53诱导的凋亡抑制作用可能与其对P21WAF’启动子转录活性的直接抑制作用有关. 3、HBx及pl4ARF单转染及共转染HePGZ细胞，单转染组其细胞凋亡率、G0/G1期阻滞细胞数、pZIWAF，启动子荧光素酶活性及p53、pZIWAF，蛋白的表第二军医大学博士学位论文中文摘要达较对照组明显升高，而共转染组与单转染P14ARF组相比其P14ARF蛋白表达及上述各项指标又进一步升高，这提示HBx可能通过依赖及非依赖Pl 4ARF途径诱导p53生成从而导致激活解lwAF，，进而引起细胞周期Gl期的阻滞及细胞凋亡的增加.而转染HBx后MDMZ表达未见明显改变，但在肝疮细胞株中存在着不同片断的MDN口，这些不同片断MDN口的存在与壬mV感染的肝细胞疮发生的个体差异是否有关还有待于进一步研究.