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目的:以大承气汤为“从肠论治”的实验方,过敏性哮喘小鼠为肺病模型,着眼于“从肠论治”对肺肠免疫细胞分化及肠道菌群的影响,探究“从肠论治”的细胞分子机制,为肺肠理论指导临床实践提供可靠的循证依据。方法:1构建过敏性哮喘小鼠模型及给药方案:本研究选取成年雌性C57BL/6小鼠为实验对象,分组情况视每次实验目的不同而定,整个研究过程基本包括4组,即正常组、模型组、“从肠论治”组及阳性药对照组。采用卵清白蛋白(Ovalbumin,OVA)诱导激发建立过敏性哮喘小鼠模型,全程可分为两个阶段:(1)两次致敏:分别于第0、14天,腹腔注射由OVA和氢氧化铝配制而成的抗原液。(2)雾化激发:自第21天起,1%的OVA溶液连续雾化激发7天,1次/天,30分钟/次。正常组予以无菌生理盐水腹腔注射及雾化吸入。“从肠论治”组,阳性药对照组于每次雾化前1h灌胃给药,正常组及模型组予等量生理盐水。2过敏性哮喘小鼠肺肠病理形态的动态观察:模型组设有造模第7天、造模21天、造模第26天和造模第28天取材。取小鼠左肺下叶和大、小肠,10%甲醛固定,常规石蜡包埋,切片,HE染色,镜下观察拍照。3探究过敏性哮喘小鼠其他非黏膜组织的损伤情况:分别取正常组和模型组小鼠心、肝、肾组织,进行常规病理组织切片,HE染色,镜下观察两组小鼠各组织的病理形态。全自动生化分析仪测定两组小鼠血清谷丙转氨酶(ALT)、血清尿素氮(BUN)水平,判断小鼠的肝肾功能是否正常。4“从肠论治”对过敏性哮喘小鼠肺肠炎症的影响:通过观察肺组织大体形态、肺指数、肺组织HE染色及PAS染色反映“从肠论治”对过敏性哮喘小鼠肺部炎细胞浸润和黏液分泌情况的影响。大、小肠形态学观察、测定肠组织长度及病理HE染色,观察“从肠论治”后肠道炎症的变化。5“从肠论治”对过敏性哮喘小鼠肺肠Th17/Treg的影响;无菌获取肺淋巴细胞和大肠固有层淋巴细胞,采用细胞流式染色法,流式细胞仪分析细胞并获得数据,比较各组淋巴细胞总数、Th17细胞和Treg细胞百分比的变化。6“从肠论治”对过敏性哮喘小鼠肠道菌群的影响;提取小鼠粪便中肠道菌群的16SrDNA,进行V3-V4区域基因序列检测,分析各组小鼠肠道菌群多样性的变化以及各组小鼠肠道菌群总数、肠杆菌科、肠球菌科、乳酸杆菌科、双歧杆菌科、拟杆菌科及梭杆菌科等主要菌群含量的变化情况。结果:1过敏性哮喘小鼠的一般情况:(1)体重变化:正常组和模型组小鼠体重变化平稳,无明显差异(p>0.05)。(2)粪便变化:模型组小鼠平均粪便粒数减少、粪便含水率下降(p<0.05),粪便湿重明显下降(p<0.01),较模型组相比。(3)激发阶段表现:模型组小鼠异常活跃,狂躁不安,抓耳挠鼻,出现呼吸急促,弓背等表现。2过敏性哮喘小鼠肺肠损伤的动态变化及特异性:(1)肺肠HE结果表明,在致敏阶段,肺肠组织结构均正常,未发现病理变化。雾化激发5天后,肺组织内出现炎性细胞浸润,大肠组织固有层也可见淋巴细胞的增多;雾化激发7天后,肺与大肠的炎性改变更加明显。(2)小肠、心、肝、肾HE结果显示均为正常组织形态,而且生化检测也表明哮喘小鼠肝肾功能正常。3各组小鼠肺大体形态、肺指数、肺组织HE染色及PSA染色结果:与正常组相比,模型组小鼠肺大体观有充血、肿胀等表现,肺指数明显增加(p<0.01),肺组织内几乎不见无正常肺泡结构,支气管周围有大量炎细胞,气管黏液分泌增加。“从肠论治”组肺指数较模型组有所下降(p<0.05),阳性药对照组肺指数也明显降低(p<0.01),两组小鼠肺组织炎性病理损伤有明显改善。4各组小鼠大、小肠形态、长度及HE染色结果:与正常组相比,模型组大、小肠未见有组织充血,水肿等变化,大肠长度显著增加(p<0.01),黏膜固有层,肌层见大量淋巴细胞浸润;与模型组相比,“从肠论治”组大肠长度明显变短(p<0.01),大肠炎性损伤减轻。三组小鼠小肠均为正常组织结构,长度未增长或变短(p>0.05)。5各组小鼠肺肠淋巴细胞总数、Th17细胞及Treg细胞百分比结果:与正常组比,模型组小鼠肺组织和大肠固有层淋巴细胞总数、Th17细胞百分比明显增加(p<0.01),肺组织中Treg比例明显减少(p<0.01),大肠固有层Treg细胞未发生明显变化(p>0.05);与模型组相比,“从肠论治”组肺组织和大肠固有层淋巴细胞总数,Th17百分比均减少(p<0.05),肺组织Treg百分比增加(p<0.05),大肠固有层Treg基本无变化(p>0.05)。6各组小鼠肠道菌群的变化情况:(1)肠道菌群多样性的变化:与正常小鼠相比,过敏性哮喘小鼠肠道菌群的结构发生改变,乳杆菌属的比例明显减少,普雷沃菌属的比例增加;Beta多样性分析显示:模型组小鼠肠道菌群的多样性发生了较大的变化,较正常小鼠相比,而且NMDS分析也显示正常组与模型组小鼠的肠道菌群存在一定的差异性。经大承气汤“从肠论治”后,肠道乳杆菌属比例增加,一定程度改善了肠道菌群的多样性。(2)肠道主要固有菌群的定性、定量分析:①菌群测序结果:与正常组相比,模型组小鼠肠道菌群总数减少(p<0.01),肠杆菌科及肠球菌科数量增加(p<0.05),乳酸杆菌科数量降低显著(p<0.05),双歧杆菌科、拟杆菌科及梭杆菌科无明显变化;经大承气汤“从肠论治”后小鼠道菌群总数增加不显著(p>0.05),肠杆菌科数量下降(p<0.05),肠球菌科和乳酸杆菌科无明显变化(p>0.05);未检测到分节丝状杆菌科。(2)平板活菌计数法结果:与正常组相比,模型组粪便中大肠杆菌,肠球菌含量量显著增加(p<0.01),乳酸杆菌数量明显降低(p<0.01);经大承气汤治疗后大肠杆菌、肠球菌均减少(p<0.01),乳酸杆菌增加(p<0.05);双岐杆菌及类杆菌在各组含量无明显差异(p>0.05)。结论:1过敏性哮喘小鼠的大肠组织可发生炎性损伤,伴发大肠传导功能失常,而其他非黏膜组织,如心、肝、肾无任何异常。2“从肠论治”对过敏性哮喘小鼠肺肠炎症有一定改善作用,其作用的可能机制是:大承气汤“从肠治肺”,药物直接作用于肠道,调节了哮喘小鼠肠道微生态的平衡,减少肠道Th17细胞的分化,通过黏膜免疫系统间的相互影响,肺部失衡的Treg/Th17也得到了纠正,最终缓解了肺部炎症。