过继性细胞免疫治疗（adoptive cell immunotherapy, ACI）是目前公认的治疗恶性肿瘤较为有效的方法之一。随着过继性细胞免疫治疗技术的日趋发展、成熟和完善，该疗法已在多种恶性肿瘤的临床治疗中取得较好疗效。　　基因工程化 T细胞过继性细胞疗法是过继性细胞免疫疗法的一种，这种疗法是将病人外周血中的T淋巴细胞通过基因工程改造，使其表达一个基因改造的T细胞受体（T cell receptor, TCR）或者表达一个嵌合性抗原受体（chimeric antigen receptor, CAR）来靶向已知的肿瘤抗原。其中基因工程化嵌合性抗原受体 T细胞的临床应用前景非常广阔。　　嵌合性抗原受体（CAR）主要由三部分组成：胞膜外抗原结合区，跨膜区和胞膜内信号转导区。胞膜外抗原结合区通常是一段单链抗体（single chain antibody fragment, scFv），具有抗原特异性，能够识别并结合肿瘤特异性抗原。跨膜区通常是由免疫球蛋白超家族组成，如CD8和CD28等。胞膜内信号转导区是由CD3的ζ链组成。　　CAR T细胞能够直接识别并结合肿瘤细胞表面相关抗原，使T细胞激活并分泌多种细胞因子，如穿孔素、颗粒酶、γ干扰素（Interferon-γ, IFN-γ）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α, TNF-α）等，对肿瘤细胞进行杀伤，发挥抗肿瘤效应。因此，CAR T细胞没有主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex, MHC）的限制性，并且CAR T技术使得效应T细胞的靶向性、增殖活性和持久性得到增强，在一定程度上打破肿瘤局部免疫抑制微环境和宿主免疫耐受状态。　　CAR T细胞已经在血液系统恶性肿瘤的临床治疗中获得成功，如急性淋巴细胞白血病和慢性淋巴细胞白血病。但CAR T细胞在实体瘤治疗中疗效有限，并且该技术还存在脱靶效应、插入突变、引起“细胞因子风暴”等临床应用风险。　　RNA结合蛋白QKI是STAR家族成员之一，可以编码多种蛋白。以往的研究表明QKI参与血管和神经的分化、发育。我们实验室的研究表明，QKI可能参与了T细胞的分化过程，提示QKI可能在CAR T细胞的治疗中发挥重要作用。　　本研究旨在构建靶向 CD19的第三代嵌合性抗原受体，在体外建立稳定表达抗CD19嵌合性抗原受体的稳转细胞系，并评价其活化效应，然后干涉 QKI的表达，检测抗 CD19嵌合性抗原受体的体外活化效应变化。最后在人源外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell, PBMC）中表达抗CD19嵌合性抗原受体，评价其体外活化效应和杀伤效应，为将来进一步优化CAR T细胞的靶向策略打下基础。　　【目的】　　1)构建靶向CD19嵌合性抗原受体的表达载体。　　2)利用Jurkat细胞系，构建稳定表达抗CD19嵌合性抗原受体的稳转细胞系，并检测其体外活化效应。然后在稳转Jurkat细胞系中干涉QKI的表达，检测其体外活化效应的变化，验证QKI对CAR T细胞的影响。　　3)分离人源PBMC，并在PBMC中稳定表达抗CD19嵌合性抗原受体，验证抗CD19嵌合性抗原受体的体外活化效应，并检测其体外杀伤效应。　　【方法】　　1)获取CAR片段，转入pCMV6-Entry质粒，构建pCMV6-Entry-CAR表达载体。通过重组酶的作用将pCMV6-Entry-CAR载体和pLenti6.3/V5-DEST质粒进行重组，构建pLenti6.3/V5-DEST-CAR表达载体。　　2)包装慢病毒并感染Jurkat细胞，建立稳定表达CAR的稳转细胞系，将稳转Jurkat细胞和 Raji细胞共孵育后，利用酶联免疫吸附测定法（ enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）检测孵育上清中白细胞介素2（interleukin-2, IL-2）的浓度，判断抗CD19嵌合性抗原受体的体外活化效应。然后在稳转Jurkat细胞系中干涉QKI的表达，和Raji细胞共孵育后，利用ELISA检测孵育上清中IL-2的浓度，验证QKI的表达下调后对其体外活化效应的影响。　　3)分离人源PBMC，并在PBMC中稳定表达抗CD19嵌合性抗原受体，然后与Raji细胞共孵育，利用ELISA检测孵育上清中IL-2的浓度，验证其体外活化效应。并且利用乳酸脱氢酶试剂盒检测孵育上清中乳酸脱氢酶（lactic dehydrogenase, LDH）的浓度，判断抗CD19嵌合性抗原受体的体外杀伤效应。　　【结果】　　1)成功构建了pLenti6.3/V5-DEST-CAR表达载体。　　2)筛选感染后的Jurkat细胞可稳定表达抗CD19嵌合性抗原受体，与Raji细胞共孵育后细胞上清中IL-2的浓度为22 pg/ml，表明我们所构建的CAR T细胞具有良好的活化效应。干涉QKI的表达后，与Raji细胞共孵育后细胞上清中IL-2的浓度增加至28.5 pg/ml，说明QKI低表达能够进一步促进CAR T细胞的活化效应。　　3)分离人源PBMC，并在PBMC中稳定表达抗CD19嵌合性抗原受体，与Raji细胞共孵育后检测细胞上清中IL-2的浓度为1757 pg/ml，进一步验证了我们所构建的CAR T细胞的体外活化效应。与Raji细胞共孵育后检测细胞上清中LDH的浓度，根据吸光度值计算得出Raji细胞的死亡率为15.3％，充分说明我们所构建的CAR T细胞具有良好的体外杀伤效应。　　【结论】　　通过本课题的研究，在 Jurkat细胞中我们利用 pLenti6.3/V5-DEST-CAR表达载体，构建了稳定表达抗 CD19嵌合性抗原受体的稳转细胞系，并证实了其具有良好的体外活化效应。在稳转Jurkat细胞系中进一步干涉QKI的表达，稳转Jurkat细胞的体外活化效应进一步增强，说明QKI在CAR T细胞的活化效应中发挥着重要的作用，为进一步明确和构建CAR T细胞提供新的研究视野。通过在人源PBMC细胞中稳定表达抗 CD19嵌合性抗原受体，同样证明了其具有良好的体外活化效应和杀伤效应，为进一步优化CAR T的临床应用提供研究基础。