禽传染性支气管炎(Avian Infectious Bronchitis,IB)是由禽传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus,IBV)引起的鸡的一种急性、高度接触性的传染病。IBV主要免疫原是三种结构蛋白：纤突蛋白S1、膜蛋白M和核蛋白N,常用于IBV抗体检测。IBV抗体检测方法很多,主要有血凝抑制试验(HI)、中和试验(NT)、对流免疫试验(CIE)、琼脂扩散试验(AGP)、酶联免疫吸附试验(ELISA)。由于IBV血清型的多样性与变异性,再加上病毒提纯难度大,使得现在的IBV抗体检测方法不是灵敏度低就是成本高,本课题设计了IBV多表位抗原,通过构建、鉴定与原核表达,初步建立了以多表位蛋白为抗原的IBV间接ELISA检测方法。1、利用生物信息学软件分析了IBV M41毒株S1、M、N结构蛋白的二级结构、亲水性、抗原性、表面可能性,以及不同毒株间的同源性。综合考虑以上各方面因素,结合文献报道,共筛选出IBV抗原表位4段D1-D4 (S1:221-356,M:165-200,N:118-270,913-1200)。利用柔性肽将4个片段依次串联成多表位抗原D。分析表明,设计的IBV多表位抗原基因D具有有良好的亲水性、柔性及抗原性等。并成功构建了IBV多表位抗原基因,经PCR、酶切、测序鉴定正确。2、IBV多表位抗原在大肠杆菌中的表达,将IBV多表位抗原基因用BamHI和XhoI双酶切后克隆入原核表达载体pGEX-4T-1,转化E.coli BL21,采用IPTG进行诱导,SDS-PAGE鉴定表明,多表位抗原大部分在上清中融合表达,同时也存在包涵体形式,分子量大小约为63KD,通过优化重组质粒的表达条件,多表位蛋白表达的最佳IPTG诱导物浓度为0.5mmol/L,诱导时间为5h,诱导温度为37℃,表达蛋白占上清中总蛋白量的12%。Western-blots显示,该融合蛋白能与抗IBV阳性血清发生特异性反应。3、以纯化的原核表达的多表位抗原蛋白为抗原包被酶标板,筛选出多表位抗原包被浓度为20μg/mL,抗体稀释度1：40,酶标二抗(HRP标记兔抗鸡IgG),稀释度1：2000,血清样品阴阳性临界值为0.084。初步建立了以多表位蛋白为抗原的IBV间接ELISA检测方法。