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目的:热应激严重损伤哺乳动物正常精子发生,但其机制尚不清楚。近年来研究表明热应激导致小鼠、大鼠、猕猴和狗等睾丸生精细胞发生凋亡,但关于热应激影响猪生精细胞的相关报道较少。本课题组先前研究了猪环境热应激条件下生精细胞凋亡的情况。本项研究通过建立猪局部睾丸热刺激模型,并检测该模型猪生精细胞凋亡数量及相关蛋白的表达,确定模型的成功建立。热应激是否会造成葡萄糖转运蛋白(glucose transporter,GLUT)表达的变化,进而影响生精细胞的代谢过程和能量摄取,损伤精子发生,未见研究报道。因此本项研究利用已成功建立的猪环境热应激模型和局部睾丸热刺激模型对睾丸组织内主要葡萄糖转运蛋白GLUT1、GLUT2、GLUT3、GLUT5、GLUT8的表达量进行检测。方法:建立性成熟长白公猪热应激处理模型。经短期环境热应激(每天置于37-40 ℃的猪舍环境3 h,连续7 d)、长期环境热应激(每天置于37-40 ℃的猪舍环境3 h,连续42 d)和局部睾丸热刺激(自制控温电热毯42 ℃热处理1h)处理。对照组,饲养于21-25℃的猪舍环境内,不进行任何处理。各组处理结束后,将睾丸利用手术摘除,部分置于液氮,用于总RNA和总蛋白的提取,利用qRT-PCR和Western blotting分别检测目的基因的mRNA和蛋白水平表达量的变化;部分置于Bouin氏固定液进行固定,用于石蜡切片的制作,利用免疫组织化学和TUNEL法分别检测目的蛋白表达和定位的变化以及生精细胞凋亡数量。结果:1.局部睾丸热刺激组细胞凋亡检测细胞凋亡检测结果显示,与对照组相比,热处理导致圆形和长形精子细胞凋亡数量增加。免疫组织化学结果显示,热处理导致Bax在精原细胞和精母细胞免疫染色增强,且Bax定位由细胞质向细胞核周围移动。热处理前后,Bcl-2均定位于细胞质和细胞核,热处理导致长形精子细胞Bcl-2染色增强。qRT-PCR和Western blotting结果显示,热处理导致Bax和Bcl-2的mRNA和蛋白表达水平升高。2.热应激条件下葡萄糖转运蛋白的表达与定位(1)热应激对葡萄糖转运蛋白mRNA和蛋白表达的影响qRT-PCR和Western blotting结果显示,与对照组相比,短期环境热应激和长期环境热应激组GLUT1 mRNA和蛋白表达差异不显著,GLUT2mRNA和蛋白表达显著升高,GLUT3、GLUT5、GLUT8mRNA和蛋白表达均显著降低。与对照组相比,局部睾丸热刺激组GLUT1、GLUT2、GLUT5、GLUT8mRNA和蛋白表达水平均显著升高,GLUT3 mRNA和蛋白表达差异不显著。(2)热应激对葡萄糖转运蛋白定位的影响免疫组织化学结果显示,GLUT1在曲精小管定位于精母细胞和圆形精子细胞;GLUT2、GLUT3、GLUT5在各级生精细胞均有表达;GLUT8定位于精母细胞、圆形和长形精子细胞。与对照组相比,短期和长期环境热应激组GLUT1蛋白染色无明显差异,局部睾丸热刺激后,GLUT1染色变深,表达升高。不同热应激处理均导致GLUT2染色变深,表达升高。短期和长期环境热应激导致GLUT3染色变浅,表达降低,局部睾丸热刺激后,GLUT3表达差异不显著。短期和长期环境热应激处理导致GLUT5、GLUT8染色变浅,表达降低,局部睾丸热刺激导致GLUT5、GLUT8染色加深,表达升高。结论:热应激条件下,猪睾丸生精细胞凋亡数量增加,凋亡相关蛋白Bax和Bcl-2表达升高。热应激导致睾丸内葡萄糖转运蛋白表达量发生改变,生精细胞对葡萄糖的摄取能力发生变化,影响正常精子发生。