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背景与目的口腔黏膜下纤维性变(oral submucous fibrosis, OSF)是一种慢性、隐匿性且具有癌变潜能的口腔黏膜疾病。OSF癌变率高达7.6%。咀嚼槟榔是OSF病变及癌变的主要原因,槟榔已被国际癌症研究中心认定为工级致癌物。临床上多数OSF患者口腔黏膜上皮萎缩,胶原堆积,仅少数患者上皮组织出现增生,在OSF癌变的组织中既有上皮萎缩又有上皮组织增生或两者并存。研究还发现OSF及癌变组织中细胞周期和凋亡相关蛋白表达异常。槟榔碱是槟榔的主要成份,槟榔碱在上皮萎缩与上皮组织增生中起何种作用及其作用机制有待研究。本研究以人永生化上皮细胞Hacat和人胚肺成纤维细胞Hel为模型,首先观察短时间高剂量槟榔碱刺激下对这两种细胞存活率,细胞周期和细胞凋亡的影响,初步探讨槟榔碱致上皮组织萎缩的分子机制。进一步,研究长时间低浓度槟榔碱诱导下对上皮细胞Hacat细胞周期、细胞迁移能力等恶性转化相关生物学特性改变的影响,为槟榔碱致OSF上皮组织病变及其癌变的发病机制提供一定的理论依据。方法1.研究短时间高剂量槟榔碱刺激对上皮细胞Hacat和成纤维细胞Hel的细胞毒性作用:MTT检测不同浓度(0,25,50,75,100,125ug/ml)槟榔碱对细胞存活率的影响;流式细胞术检测槟榔碱对细胞周期及凋亡的影响;然后采用RT-PCR、Western blot检测细胞周期相关调控蛋白的mRNA和蛋白表达水平的差异;Western blot检测细胞凋亡调节的相关分子;琼脂糖凝胶电泳检测槟榔碱诱导下凋亡细胞DNA切割形成的DNA Ladder;报告基因实验检测槟榔碱对CyclinDl启动子活性的影响;CO-IP实验检测槟榔碱对CyclinDl的泛素化调节。2.检测低浓度槟榔碱长时间诱导下七皮细胞Hacat周期及迁移能力等与细胞恶性转化及癌变相关生物学特性的改变:MTT检测低浓度槟榔碱诱导不同时间对细胞存活率的影响;报告基因实验、Western blot检测细胞周期蛋白CyclinDl的启动子活性和蛋白表达水平;Western blot检测MMP-9蛋白的表达,RNAi实验初步确定槟榔碱诱导下调控MMP-9表达的转录因子;Transwell实验检测低浓度槟榔碱对上皮细胞Hacat运动能力的影响。结果1.MTT实验结果:50μg/ml及以上槟榔碱作用24h时明显抑制上皮细胞Hacat的存活,呈浓度、时间依赖性(P<0.05);而100μg/ml及以上浓度才影响成纤维细胞Hel的存活,且无时间依赖性。20μg/ml槟榔碱作用2m,3m,4m,5m时促进上皮细胞Hacat存活(P<0.05)2.流式细胞术结果显示:75,100,125μg/ml槟榔碱干预上皮细胞12小时将周期阻滞于G1/S期,而对成纤维细胞Hel周期无明显影响;50,75,100,125μg/ml槟榔碱干预24小时诱导上皮细胞Hacat凋亡Hacat并呈剂量依赖性,随浓度升高,晚期凋亡细胞的比例也不断上升。3. Western blot和RT-PCR表明:0,25,50,75,100,125μg/ml槟榔碱处理上皮细胞Hacat24h,抑制早G1期周期蛋白CyclinDl及CDK4的表达;并促使晚G1周期素依赖的蛋白激酶CDKK2及E2F1的表达下调;而对晚G1期细胞周期素CyclinA和CyclinE表达稍有上调;对G2/M期演进调控蛋白CyclinB/CDC2表达影响不明显。4.报告基因实验结果:50、75、100、125μg/ml槟榔碱作用24h显著抑制上皮细胞Hacat CyclinDl启动子活性(P<0.05);20μg/ml槟榔碱诱导4m,5m后逐渐上调CyclinDl启动子活性(P<0.05)5.CO-IP实验:0,25,50,75,100,125μg/ml的槟榔碱干预上皮细胞Hacat 24h诱导CyclinDl的泛素化,促进其泛素化降解。6.Western blot结果:75,100,125μg/ml槟榔碱干预上皮细胞Hacat24小时上调促凋亡基因Bax并抑制抗凋亡基因Bcl-2的表达;25,50,75,100/ml槟榔碱干预24小时促进caspase-3的表达上调并诱导其活化;25,50,75,100,125/ml槟榔碱干预24小时促进caspase-8、caspase-9的表达上调并诱导其活化。7. Western blot结果显示:50,75,100,125μg/ml浓度槟榔碱诱导上皮细胞Hacat 24h NF-κB、AP-1、Ets-1和MMP-9的表达上调;Si-RNA处理NF-κB、AP-1、Ets-1三种转录因子后50μg/ml槟榔碱干预上皮细胞Hacat 24h MMP-9表达下调,其中NF-κB的诱导效应最明显。8.Transwell迁移实验:20μg/ml槟榔碱作用2m,3m,4m,5m后促进上皮细胞Hacat的迁移能力。结论1.短时高浓度槟榔碱能抑制上皮细胞存活,并将其阻滞于G1/S期主要通过下调CyclinD1、CDK4、CDK2和E2F1的表达来实现;还能抑制上皮细胞CyclinDl的启动子活性,诱导其蛋白发生泛素化降解;诱导上皮细胞凋亡,促进caspase-3,8,9的表达和活化,上调促凋亡基因Bax并抑制抗凋亡基因Bcl-2的表达。对成纤维细胞的存活和周期影响不明显。槟榔碱诱导上皮细胞周期阻滞并促其凋亡,增殖与凋亡失衡可能是多数OSF发生上皮萎缩的原因。2.长时低剂量槟榔碱能上调CyclinDl的启动子活性,加速上皮细胞周期进程。槟榔碱主要通过NF-κB呈时间和剂量依赖性上调MMP-9的表达,并增强上皮细胞的运动能力,促进其迁移。低浓度的槟榔碱长期诱导使上皮细胞逐步获得增殖、侵袭与转移等恶性潜能可能是部分OSF出现上皮组织增生并癌变的原因。