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目的体外复制RAW264.7巨噬细胞源性泡沫细胞模型,探讨参附注射液(Shenfu Injection,SFI)是否通过诱导细胞自噬而发挥促进胆固醇流出的作用,为相关基础研究及动脉粥样硬化(Atherosclerosis,AS)的临床预防和治疗提供实验依据。方法1.复制模型,评价药效用ox-LDL干预RAW264.7巨噬细胞以复制巨噬细胞源性的泡沫细胞模型,SFI作为研究药物,采用油红O染色以定性分析不同浓度的SFI对泡沫细胞内ox-LDL蓄积的影响,并使用异丙醇抽提细胞内油红O染料含量以定量分析不同浓度的SFI对细胞内脂质含量的影响;采用RT-q PCR检测细胞胆固醇转运相关因子ABCA1、ABCG1、PPARγ、LXRα、SR-A1、CD36 m RNA表达情况;2.基于自噬探讨SFI的作用机制用SFI和自噬抑制剂LY294002分别干预细胞,采用MDC荧光染色观察自噬发生情况;油红O染色评价各组干预后对RAW264.7细胞内ox-LDL蓄积的影响;RT-q PCR用于检测细胞胆固醇转运和自噬相关因子m RNA表达水平,Western Blot用于检测自噬相关蛋白LC3II/LC3I比值和P62/SQSTM1蛋白水平,探讨SFI促进胆固醇流出可能机制是否与通过上调自噬促进脂质转运有关。结果1.SFI对RAW264.7巨噬细胞源性泡沫细胞胆固醇流出的疗效评价(1)油红O染色观察泡沫细胞内脂质聚集:对照组细胞中几乎无脂质堆积;模型组和不同浓度SFI组细胞中可见不同程度橘红色脂质堆积,除8μl/ml浓度的SFI组外,其余SFI各组红染面积较模型组少。(2)异丙醇抽提定量结果:加入ox-LDL诱导干预后,细胞内相对油红O染料含量明显升高,除8μl/ml浓度的SFI组外,其余SFI浓度组油红O染料含量低于模型组(P<0.05)。结合油红O染色及异丙醇抽提定量结果表明,SFI能减少RAW 264.7细胞内ox-LDL蓄积。(3)SFI对胆固醇转运相关因子m RNA表达的影响:加入50μg/ml ox-LDL干预后,SFI可上调RAW 264.7细胞中4种胆固醇流出相关因子ABCA1、ABCG1、PPARγ、LXRαm RNA的表达,且2μl/ml浓度的SFI效果最好(P<0.01);而清道夫受体SR-A1、CD36 m RNA的表达水平无明显变化(P>0.05)。2.基于自噬探讨SFI对ox-LDL诱导RAW 264.7细胞的影响及机制研究(1)MDC染色于荧光显微镜下观察,结果表明:相较于对照组,模型组MDC细胞荧光强度较弱,细胞内绿色颗粒明显减少;与模型组MDC荧光强度相比,在SFI组中较强,绿色颗粒在细胞内明显增加。结果提示,SFI能明显诱导泡沫细胞内自噬的发生。(2)SFI对自噬相关细胞因子m RNA和蛋白表达情况:与模型组相比,SFI组自噬标记物LC3B m RNA表达水平和蛋白比值LC3II/LC3I均显著升高(P<0.05),P62 m RNA和蛋白的表达量降低(P<0.05),其结果均位于对照组和模型组之间。(3)自噬影响介导胆固醇流出的转运蛋白的反向验证:油红O染色于光镜下观察,对照组细胞中几乎无脂质堆积;其余各组细胞内可见不同程度的橘红色脂质聚集,SFI组橘红色染色面积明显小于模型组,且未明显减少LY294002抑制自噬后RAW 264.7细胞内ox-LDL的蓄积,结果提示SFI诱导的自噬,促进泡沫细胞内胆固醇向胞外转运。自噬对RAW 264.7细胞内胆固醇流出相关因子m RNA及蛋白表达的影响结果显示,SFI联合LY294002抑制自噬的效果较单独LY294002作用无明显差异。故SFI可明显诱导RAW 264.7泡沫细胞内的自噬水平,促进细胞内胆固醇流出相关因子,发挥促进脂质逆向转运的作用。结论1.SFI可减少巨噬细胞内脂质蓄积,抑制泡沫细胞生成,其机制与上调胆固醇转运因子ABCA1、ABCG1、PPARγ、LXRαm RNA表达水平有关;2.通过增加LC3II/LC3I比值、下调P62表达诱导自噬,是SFI上调胆固醇转运因子进而促进脂质逆向转运的潜在机制。