背景糖尿病肾病(diabetic kidney disease,DKD)是糖尿病主要的微血管并发症之一,并且是引起终末期肾病(end stage of renal diseases,ESRD)最常见的原因。糖尿病肾病的临床分期如下：Ⅰ期：正常蛋白尿期,尿白蛋白/肌酐比率(urinary albumin/creatinine ratio,UACR)<30mg/g肌酐；Ⅱ期：微量蛋白尿期,UACR在30-300mg/g肌酐；Ⅲ期大量蛋白尿期,UACR≧300mg/g肌酐或者伴随持续蛋白尿伴血肌酐浓度<1.2mg/dl；Ⅳ期：慢性肾功能衰竭,血肌酐浓度至1.2mg/dl伴蛋白尿；V期：慢性透析治疗。以往有人认为糖尿病肾病是一个单方向的过程,一旦发生微量白蛋白尿就直接发展为终末期肾病。但最近的研究表明,有些已被诊断为糖尿病。肾病的患者又恢复到正常蛋白尿状态,即使在微量蛋白尿阶段,有三分之一的糖尿病肾病患者失去了肾功能。因此,在诊断糖尿病肾病时,需要更灵敏更有特异性的标志物。尿液对寻找诊断性标志物的研究是最有用的实验材料。因为它易于从患者处获得,收集过程十分方便并且为非侵入性。除了可溶性的血浆蛋白,尿液中的微囊泡,如胞外体和微粒,最近成为了尿液蛋白分析的靶点。尿液胞外体(exosome)是一种由小管细胞分泌的直径为40-100nm的膜性囊泡,而微粒是一种无膜结构的大小在100-1000nm的微泡。胞外体和微粒均以同样的脂质双层结构为特点,而大部分从尿液中分离的微囊泡被认为是胞外体。有报道证实了水通道蛋白-2仅仅存在于尿液胞外体中,而其他来源的胞外体中没有。这些胞外体可能为肾脏结构和功能损伤提供理想的生物标志物。已有报道表明二肽基肽酶-4(dipeptidyl peptidase-4,DPP4,即CD26)与糖尿病有密切的关系。DPP4是一种膜相关蛋白,在所有组织中广泛的表达,其在肾脏异位聚集,主要位于皮质、刷状缘和微绒毛碎片中。DPP4可降解活性胰高血糖素样肽-1(glucagon-like peptide-1,GLP-1), GLP-1是餐后由小肠L细胞分泌的肠降血糖素,可以通过葡萄糖依赖的途径增加胰岛素分泌。DPP4抑制剂沙格列汀和西格列汀已被批准用于2型糖尿病患者饮食和运动控制不佳的治疗。我们推测DPP4是尿液胞外体的组成成分,尿液中的胞外体浓度也许反映肾小管上皮细胞的损伤。我们用胞外体特异性特异性抗体(AD-1)和酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)检测尿液胞外体中的DPP4。 AD-1固定在板上后,这种抗体可以特异性捕获及纯化尿液中完整的胞外体,同时胞外体中DPP4的活性可以被测定。通过这种方法,我们测定了2型糖尿病患者尿液中的胞外体结合的DPP4活性,并且与年龄和性别匹配的正常个体进行对比。我们推测不同个体尿液样本的水合状态也许会导致尿液水/盐含量的不同,从而留取了24h尿,然后将其中的一部分用于我们的分析。我们评价胞外体结合的DPP4用作糖尿病肾病早期的生物标志物的效果。目的1.证实糖尿病肾病患者血液及尿液中存在胞外体。2.尿胞外体结合的DPP4在正常人、糖尿病患者、糖尿病肾病微量白蛋白尿患者、糖尿病肾病大量白蛋白尿患者中的变化。方法1.选取127例2型糖尿病患者,根据24h尿白蛋白肌酐比分为糖尿病正常白蛋白尿组(DM,43例),微量白蛋白尿组(DN1,50例),大量白蛋白尿组(DN2,34例)。健康对照组34例。2.采用特异性的单克隆抗体提纯胞外体,并验证抗体特异性,使用电镜对胞外体进行形态学鉴定。3.酶联免疫吸附法检测尿液exosome-DPP4的水平及血exosome-DPP4水平,滤过离心的方法检测尿游离DPP4水平,使用Western Blot方法对胞外体进行分子标记物鉴定。4.同时检测糖化血红蛋白(液相色谱法)、血胆固醇(化学修饰法)、肌酐(苦味酸法)、尿素氮(速率法),尿白蛋白的测定由芬兰Quickread101分析仪完成,结果采用UACR报告。5.应用逐步多元回归方法分析DPP4与糖化血红蛋白、血胆固醇、肌酐、尿素氮、UACR相关性。结果1.血和尿中均存在胞外体,其形态是脂质双层膜结构。2.血、尿的DPP4同源,尿exosome-DPP4是尿中DPP4的主要存在形式。3.DM.DN1、DN2组尿exosome-DPP4水平均显著高于正常组(均P<0.01),尿exosome-DPP4与糖化血红蛋白、血胆固醇、肌酐、尿素氮、UACR具有显著相关性。逐步多元回归分析显示,UACR.糖化血红蛋白是尿exosome-DPP4的独立危险因素(均P<0.001)结论尿exosome-DPP4水平与糖尿病肾病严重程度密切相关,对于糖尿病肾病诊断及预后的估计具有一定的临床价值。背景目前研究认为不仅1型糖尿病是一种自身免疫性疾病,2型糖尿病的发病也与机体的免疫功能密切相关。2型糖尿病是在遗传基础上由多因素促成的,患者有免疫机制的异常,其胰岛细胞抗体(Islet cell antibody, ICA)阳性者比ICA阴性者有更严重的β细胞损害。糖尿病肾病是其最常见的慢性并发症,因其发病机制不明,故其早期诊断与治疗已成为临床工作面临的重要课题。T淋巴细胞在调节炎症反应中起到了重要的作用,其中特别是辅助性T淋巴细胞(Thelper cell, Th)更为受到关注。IFN-γ可介导β细胞的直接毒性作用；刺激巨噬细胞、淋巴细胞,对胰岛β细胞进行直接杀伤。IL-4因子主要由2型辅助性T淋巴细胞(Th2)产生,介导体液免疫,调节抗体生成。干扰素-γ(Interferon-gamma, IFN-γ)/白介素-4(Interleukin-4, IL-4)的比值代表1型辅助性T细胞(Th1)和Th2的水平变化,目前研究认为Th亚群的激活以及Th1/Th2比例的失衡,参与了动脉粥样硬化、支气管哮喘等多种炎症反应相关疾病的病理过程,但其在2型糖尿病发病机制中的作用尚不完全清楚。目的探讨2型糖尿病患者尿液胞外体Th1/Th2的水平变化及在糖尿病肾病发生发展过程中的意义。方法选取120例2型糖尿病患者及健康对照组30例。采用特异性的单克隆抗体提纯尿胞外体,酶联免疫吸附法(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测尿液胞外体(Exosome)-IFN-γ、exosome-IL-4的水平。应用逐步多元回归方法分析Th1/Th2与糖化血红蛋白、胆固醇、尿白蛋白肌酐比、肌酐、尿素氮相关性。结果尿exosome-Th1/Th2与尿白蛋白肌酐比(P=0.015)、尿素氮(P=0.001)相关,进一步进行逐步多元回归分析显示尿素氮是exosome-Th1/Th2的独立危险因素(P=0.006)。结论尿exosome-Th1/Th2漂移与糖尿病肾病的早期诊断有密切的关系,具有一定的临床价值。背景慢性’肾脏病(Chronic kidney disease,CKD)是最常见的严重危害人们身心健康的一类肾病,近年来其发病率呈稳步上升的趋势,平均每年的发病率增加约5%-8%,已经成为全球性重要的公共卫生问题。据2007年2月20日国际肾脏病学会的公告,全球每10人中就有1人患有肾脏疾病,每年死于与慢性肾脏病相关的心血管疾病患者超过10万人。慢性肾功能不全临床症状隐匿,可以完全没有症状或症状不明显,而且肾脏的代偿功能极其强大,即使肾脏功能已经损失50%以上的肾功能不全患者仍可能没有任何症状。常见的慢性肾病有糖尿病肾病、高血压肾病、药物性肾病、1gA肾病和狼疮性肾病。慢性肾病如不及时治疗,将发展成为慢性肾功能衰竭(Chronic renal failure, CRF)和尿毒症。对于肾衰期和尿毒症期患者,目前除血液净化、腹膜透析和肾移植外,尚无理想的治疗方法。我们通过研究慢性肾病患者尿胞外体结合型酶及自由型酶的含量变化,来发现与慢性肾病有关的特异性强的标志物。目的探讨慢性肾病肾功能不全患者尿液胞外体结合型及自由型碱性磷酸酶(Exosome-alkaline phosphatase, EXO-ALP)、γ-谷氨酰转肽酶(Exosome-Gamma-glutamyl transferase, EXO-y-GT)及亮氨酸氨基肽酶(Exosome-Leucinea minopeptidase, EXO-LAP)的水平变化。方法选取10例2型糖尿病肾病、10例狼疮性肾病、10例止痛剂肾病,符合慢性肾病第1V期标准,健康对照组14例。采用特异性的单克隆抗体(AD-1)提纯尿胞外体,利用胞外体携带的碱性磷酸酶作为标记物,鉴定抗体对胞外体的特异性。用琼脂糖凝胶方法分离碱性磷酸酶同工酶,通过免疫层析方法检测尿液EXO-ALP、EXO-y-GT、EXO-LAP的水平及自由型ALP、γ-GT及LAP水平。结果1AD-1抗体分别与不同的自由型ALP和EXO-ALP反应,仅仅EXO-ALP可以与抗体结合。2把EXO-ALP与AD-1反应,然后把反应物进行琼脂糖电泳,可见EXO-ALP与抗体结合后,电泳迁移率降低。3免疫层析结果表明正常人尿胞外体结合型ALP、LAP和γ-GT的含量高于自由型的ALP、LAP和γ-GT,3种慢性肾病肾功不全的病人尿胞外体结合型ALP、LAP和γ-GT及尿自由型γ-GT的含量明显下降,而自由型ALP、LAP酶水平升高。结论慢性肾病肾功能不全患者尿胞外体结合型的三种酶水平均较正常人降低,机制还需进一步研究。