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布鲁氏菌病（Brucellosis,简称“布病”）是由胞内寄生菌——布鲁氏菌（Brucella spp.）引起的一种人兽共患传染病,该病严重影响我国的畜牧业的发展,造成重大经济损失。我国目前对布鲁氏菌病的检测主要以细菌学、血清学检测方法为主,这些方法存在着费时费力、假阳性、以及无法区分死菌等缺点,同时不能对病原进行快速检测和种间鉴定。因此,开发布鲁氏菌病快速检测方法对布病的防控与净化具有重要意义。本课题致力于研究布鲁氏菌的快速检测方法,以核酸扩增技术为基础,建立一系列检测方法,为布鲁氏菌病的科学研究、防控与净化,提供切实有效的布鲁氏菌检测技术手段。1、通过将叠氮溴化丙锭（Propidium Monoazide,PMA）与荧光定量PCR（Fluorescence Quantitative PCR,qPCR）结合建立一种布鲁氏菌活菌数的快速定量检测方法。以布鲁氏菌单拷贝BCSP31基因为检测靶标,构建重组标准质粒,绘制标准曲线。优化qPCR反应条件及PMA最佳应用浓度与曝光时间,对该方法的灵敏度、特异性、重复性等进行分析。结果显示,CT值与标准质粒拷贝数浓度对数值之间线性关系良好;灵敏度为103 CFU/mL,比普通PCR方法灵敏100倍,且特异性及重复性良好;活/死菌混合样本定量分析证实活菌数测定值与理论值相似,且符合活菌数变化规律;与平板计数法共同测定猪种布鲁氏菌（B.suis）S2株侵染巨噬细胞后的胞内活菌数,两种方法所测定值之间有统计学差异,但数量级相同,可能与部分胞内菌进入体外非可培养状态有关。该方法适用于快速评价布鲁氏菌活菌数,在研究体内或胞内布鲁氏菌寄生能力及感染状态具有一定的可应用性。2、基于重组酶聚合酶扩增（Recombinase Polymerase Amplification,RPA）技术建立布鲁氏菌快速可视化检测方法。针对BCSP31基因设计多对引物并进行筛选,在引入SYBR Green I对RPA扩增产物进行可视化检测时,为了消除RPA的背景信号,对引物浓度及扩增时间进行优化,随后对该方法的特异性、灵敏度及重复性进行评价,并应用该方法对血清、牛肉及牛奶三种模拟样品进行检测。结果显示使用最优引物利用RPA技术进行可视化检测时,在40℃条件下扩增15min后,加入2μL的50×SYBR Green I,使用395 nm波长的紫外灯照射可实现可视化检测。该方法的灵敏度为1.41358×10-33 ng/μL,特异性、重复性良好,应用该方法对模拟样品检测结果与《GB/T 18646-2018动物布鲁氏菌病诊断技术》Bruce-Ladder检测结果相符。该方法无需复杂昂贵仪器,检测时间短,为检测条件相对落后的地区实现布鲁氏菌现场检测提供可应用的方法。3、针对牛种、羊种、猪种布鲁氏菌基因组差异序列分别设计RPA引物,构建多重RPA体系,优化反应条件,建立一种同时检测牛种、羊种、猪种布鲁氏菌的多重RPA检测方法。对该方法的灵敏度、特异性以及重复性进行评价,并应用该方法对血清、牛肉、牛奶三种模拟样品进行检测。结果显示,本研究所建立的多重RPA检测方法通过特定的引物组对样品进行多重RPA检测,对牛种布鲁氏菌检测灵敏度为10 pg/μL,对羊种布鲁氏菌和猪种布鲁氏菌检测灵敏度均为1 pg/μL。应用该方法对模拟样品检测结果与《GB/T 18646-2018动物布鲁氏菌病诊断技术》Bruce-Ladder检测结果相符。本研究建立多重RPA检测方法快速、灵敏、特异,可同时检测牛种、羊种、猪种布鲁氏菌。牛种、羊种、猪种布鲁氏菌引发的布病疫情高达93%,所建立的牛种、羊种、猪种布鲁氏菌多重RPA检测方法可用于多数布病分离菌株的鉴别检测。4、基于动物布鲁氏菌病诊断技术国家标准的Bruce-Ladder法,研制一种布鲁氏菌可视化PCR检测试剂盒,该试剂盒对布鲁氏菌Bruce-Ladder检测方法进行改进,可对布鲁氏菌进行现场种属鉴别检测,同时简化检测条件与步骤,大大缩短检测时间。本试剂盒包括含有PCR Mix、上下游引物以及SYBR Green I混合体系的八联管、ddH2O和阳性质控模板,检测时只需将样本与ddH2O混合加入八联管中,进行PCR扩增程序,反应结束后各管用300 nm500 nm的紫外灯照射,根据各管底反应体系颜色或荧光亮度情况,即可完成布鲁氏菌种间鉴定。本试剂盒具有特异性强、灵敏度高、重复性好、操作简单快速、结果易于判定、便于现场应用等优点,为布鲁氏菌种属鉴定和现场检测应用提供工具。综上所述,本研究建立三种布鲁氏菌检测方法,并研制一种基于Bruce-Ladder法的布鲁氏菌可视化检测试剂盒,既可实现对布鲁氏菌的活菌数快速定量检测,又可完成布鲁氏菌的快速可视化检测以及种间鉴定,为布鲁氏菌病的防控与净化提供技术支持。