论文部分内容阅读
单纯疱疹病毒性角膜炎(HSK)主要是由单纯疱疹病毒I型(HSV-1)直接感染角膜上皮细胞引起的点状或树枝状角膜炎;在角膜基质内发生的免疫反应,引起盘状、基质坏死性角膜炎;由于HSV-1的特性能够潜伏于三叉神经节造成复发感染, 在机体免疫力被抑制时,潜伏感染的HSV-1可重新活化,引起HSK的复发,由于HSK的反复发作造成视力严重损害甚至失明。目前针对HSK尚无特效疗法,从非选择性的竞争抑制病毒DNA酶的抗疱疹病毒类药物到比较有选择性病毒核苷激酶的抗HSV-1药物,再加上干扰素及不同类型的抗病毒药物的联合应用,使HSV-1的感染发生控制在较低的水平,但由于抗生素、激素的不合理使用,病毒耐药株的不断出现,机体的免疫功能受到干扰以及对HSV-1潜伏机制尚不清楚和一些药物全身应用时毒副作用,使其在临床应用时受到限制,迄今还未达到理想的治疗效果,故寻求特异性强、效果更好的抗病毒药物和研制抗HSV-1的安全疫苗来预防HSV-1的感染和复发,国内外许多学者认为针对HSV-1特异性自动免疫是控制感染的最有效途径。因此,研制疫苗是单纯疱疹病毒防治的重要方向。 HSV-1疫苗按其特点和作用机理可分为灭活病毒疫苗、减毒活疫苗、亚单位疫苗、肽疫苗、活载体疫苗、和核酸疫苗。核酸疫苗是近十年来发展起来的一种新的疫苗形式,可以诱导机体全面的细胞免疫和体液免疫应答,在胞内寄生病原体疫苗防治上具有广阔的应用前景。由于核酸疫苗是将抗原基因的质粒DNA直接导入体内,利用其表达的抗原蛋白诱导机体的免疫应答反应,因此必须将抗原编码基因克隆入表达载体中。核酸疫苗是由病原的保护性抗原基因和载体质粒构成;核酸疫苗的构建方法是将目的基因片段插入载体;插入基因片段是病原体保护性抗原的编码基因,其可以是单个基因、完整的一组基因,也可以是编码抗原决定簇的一段核苷酸序列,其表达产物为病原体有效的抗原部分,可诱发机体产生保护性免疫。 本研究选用的是HSV-1 gB基因,gB糖蛋白就有较强的免疫原性,可诱<WP=57>导机体产生中和抗体和细胞免疫反应。gB糖蛋白是在感染细胞中含量最多的蛋白,是感染宿主细胞免疫和体液免疫的主要靶抗原,也是HSV-1特定细胞毒T淋巴细胞(CTL)主要靶抗原。小鼠接种重组形式的gB蛋白在体内产生中和HSV-1抗体,在腹膜内或脚蹼接种不同毒株具有完全免疫保护作用,保护小鼠不被致死剂量病毒致死,并且非常有效地抑制潜伏感染和复发感染的建立,与接种减毒活疫苗保护作用相似;gB蛋白诱导免疫保护作用具有长时效特点,明显保护三叉神经节免于感染;也有实验表明鼠接种分泌形式的gB蛋白对由HSV-1感染引起的角膜炎,脑膜炎和死亡具有明显保护作用;此外HSV-1 gB糖蛋白具有高度保守性,各毒株间差异较小,且与HSV-2病毒感染具有交叉保护作用。因此,HSV-1 gB糖蛋白是构建单纯疱疹病毒基因疫苗比较理想的侯选目的基因。 本实验利用的载体是pcDNA3,主要有以下几部分构成:①来源于人类巨细胞病毒的早期启动子/增强子PCMV ,具有较强的表达下游基因的能力;②来源于牛生长激素基因的polA信号,以保证转录出的mRNA的稳定;③来源于大肠杆菌的ColEl,以便重组质粒在细菌中高拷贝复制;具备理想的哺乳动物细胞表达载体应具有的特点。 本研究利用PCR技术从HSV-1 SM44株基因组中扩增出编码HSV-1 gB去除N端部分信号肽序列(39bp)的基因片断(2673bp),定向插入真核表达质粒pcDNA3载体中,构建出重组真核表达质粒pcDNA-gB,并对其进行酶切分析、PCR鉴定及测序分析;通过中和试验、ELISA方法及病毒攻击试验检测用pcDNA-gB三次肌肉接种小鼠的免疫效果。经过双酶切酶切分析、PCR鉴定及测序鉴定,我们可以确定该重组质粒构建成功,且HSV-1 gB的2673个碱基中仅有3个发生变异,碱基序列一致性达99.5%,与HSV-1不同毒株gB的序列也高度同源,同源性达99.0%;gB推测的氨基酸序列与HSV-1 F株的gB氨基酸序列比较,891个氨基酸中,有1个发生变异,且变异的碱基对HSV-1 gB N端糖基化部位、连续抗原表位无影响,其免疫原<WP=58>性应该不会受到影响。为了确定pcDNA-gB能否在动物体内正确表达及是否具有免疫保护作用,进行了初步的动物实验,利用pcDNA-gB免疫接种小鼠,经ELISA方法在小鼠血清中检测到了HSV-1特异性的抗体(抗体滴度:中和试验法1:41,ELISA法1:213),表明pcDNA-gB能够在小鼠体内表达gB蛋白;并诱导产生了特异性免疫应答,这种特异性的免疫应答减低了攻击病毒引起的小鼠死亡率(存活率80%),对小鼠具有良好的保护作用,与文献报道的一致,但是否能够防止发生潜伏感染尚需进一步研究。 本实验已成功地构建了HSV-1 gB 基因疫苗,在初步动物实验中显示出对动物的免疫保护作用,可以成为防治HSV-1的候选疫苗;然而对于如何优化该DNA疫苗,我们还有大量的工作尚未开展,比如,最佳免疫剂量的摸索、免疫前的预处理等等。由于基因疫苗具有安全、稳定、制备简单、易于保存等特点,有希望成为防治HSV-1感染的主要疫苗。但是,基因疫苗的历史毕竟很短,实验结果均来自动物,在用于人体之前还有许多工作必须完成,其中最重要的是解决基因疫苗对人体的安全性和效