穿山龙总皂苷体内外抗炎作用及机制研究

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穿山龙(Dioscorea nipponica Makino)为穿龙薯蓣的干燥根茎,其来源较为广泛,价格相对低廉,具有抗炎、降糖、调节免疫功能、改善心血管功能和保肝等药理作用,其主要成分为皂苷类、黄酮类和菲类等,课题组前期研究表明皂苷类化合物具有良好的抗炎活性。炎症可由细菌、病毒和寄生虫等诱发产生,影响畜禽健康,甚至会导致死亡,减少了养殖企业的经济效益,影响了畜牧行业的可持续发展。目前临床上主要应用甾体和非甾体类抗炎药对炎症进行预防和治疗,虽然治疗效果良好,但也存在较多的不良反应,而中药具有低毒和药理作用靶点多等特点。因此,从中药中开发抗炎药物成为诸多学者关注的研究热点。本试验以穿山龙总皂苷为研究对象,考察其提取工艺、化学成分和体内外抗炎作用及机制为兽医临床抗炎药物的研发提供一定的研究思路和方法。本研究采用单因素和响应面试验优化穿山龙总皂苷的最佳超声提取工艺;采用超高液相色谱-四级杆串联飞行时间质谱(UPLC-QTOF-MS)方法初步分析穿山龙总皂苷的主要化学成分;利用脂多糖(LPS)诱导的RAW 264.7细胞和急性肺损伤(ALI)小鼠模型,采用酶联免疫吸附剂法(ELISA)测定细胞上清液和小鼠肺灌洗液中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-10(IL-10)和干扰素β(IFN-β)的含量;采用Griess法、中性红吞噬试验和HE染色法分别检测炎症介质NO的水平细胞吞噬作用和肺组织损伤情况,揭示穿山龙总皂苷的体内外抗炎活性;同时采用实时荧光定量PCR法(RT-PCR)和免疫印迹法(WB)对My D88依赖和非依赖信号转导通路中TLR4、TRAF6、p65、p-p65、IκB、p-IκB和TRIF的m RNA和蛋白表达水平进行检测,揭示穿山龙总皂苷的抗炎作用机制。本研究确定了超声提取条件下穿山龙总皂苷的最优提取工艺为:乙醇浓度50%,超声时间25 min,液料比55:1(m L/g),该条件下穿山龙总皂苷的含量为1.72%;并初步推断出穿山龙总皂苷中的18种化学成分;体内外抗炎试验结果表明,穿山龙总皂苷能显著抑制RAW264.7细胞吞噬活性,降低ALI小鼠肺湿/干重比值,能够极显著降低TNF-α、IL-6、IFN-β和炎症介质NO的含量,促进IL-10的分泌,并呈剂量依赖式下调TRAF6、TLR4和TRIF的m RNA和蛋白表达水平,抑制p65和IκB蛋白的磷酸化,揭示穿山龙总皂苷可通介导My D88依赖性和非依赖信号通路发挥抗炎作用。综上所述,本试验成功优化出穿山龙总皂苷的最佳提取工艺,并明确其主要化学成分;同时明确穿山龙总皂苷具有较好的体内外抗炎作用;且进一步揭示了穿山龙总皂苷可通介导My D88依赖性和非依赖性信号通路发挥抗炎作用,为兽医临床抗炎中药的研究和开发提供了重要理论依据。
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