背景毒性弥漫性甲状腺肿(GD)是一种器官特异性自身免疫性疾病,约占全部甲亢的90%,其发病率逐年升高,女性显著高发。GD以高代谢症候群和甲状腺肿大为主要特征,存在高复发率、需长期用药、副作用大、停药指征不明确等问题,严重影响患者正常生活。目前普遍认为遗传、外环境和免疫三个方面相互作用,共同决定GD的发病。而近年来,GD的免疫学发病机制越来越受关注,T细胞亚群及其相关调控因子与GD的关系研究成为热点。T细胞及其相关调控因子等参与免疫应答并产生促甲状腺激素受体抗体(TRAb)等自身抗体,从而引起GD的发生和发展。临床针对Graves病主要有抗甲状腺药物(ATD)治疗、131I治疗和手术治疗等手段。其中抗甲状腺药物疗法是最常用的方法,但其副作用大,易复发。而祖国医学治疗Graves病具有独特的优势,可以减少甲状腺药物用量和减轻甲状腺药物副作用。中医认为痰是GD产生的重要原因,贯穿于甲状腺肿大的始终,也是GD证候的基础,与其他病因结合,形成不同的证候类型。因此化痰散结法是中医治疗GD的根本所在,可以有效改善GD患者甲状腺肿大。前期实验研究非含碘化痰散结中药治疗GD的机制,证明化痰散结中药能抑制甲状腺细胞增殖,促进甲状腺细胞凋亡,影响Bax、Bcl-2表达,改善甲状腺细胞增殖／凋亡的动力学平衡关系。但是,目前尚没有针对GD的中医证候与T细胞亚群介导的细胞免疫的相关性的探索,且化痰散结中药对GD细胞免疫的干预机制研究亦较少,严重限制了中药的广泛应用。因此,本研究是以Graves病为核心,临床实验以中医证候为立足点,以细胞免疫为切入点,动物实验以Ad-TSHR289病毒免疫的小鼠构建GD模型为载体,以非含碘化痰散结中药为干预措施,以T细胞亚群为对象,进一步探讨GD中医证候与细胞免疫的相关性,化痰散结中药对T细胞亚群的影响机制,具有一定的临床参考意义和应用价值。目的1.探讨GD患者的中医证候与细胞免疫的相关性。2.探讨化痰散结中药对GD小鼠模型脾脏T细胞亚群的影响。方法1.中国中医科学院广安门医院内分泌科门诊收集30例GD患者,其中16例甲功异常者,14例经治疗后甲功正常者,以20例健康成人作为正常对照组。统计分析各组之间的一般情况、症状体征、甲功、免疫学指标(流式细胞技术检测Th17细胞比例,PCR法检测Foxp3、RORγt的mRNA表达,ELISA法检测IL-10、IL-17含量),采用多重线性回归方法分析中医证候与免疫学指标之间的相关性。2.采用PCR融合扩增获得质粒,Gateway技术构建载体,并进行腺病毒包装,成功构建Ad-TSHR289重组腺病毒。通过腺病毒免疫小鼠制备GD动物模型,按照正常组小鼠T4、TRAb的(x+3s)筛选成模小鼠,进行化痰散结中药干预,采用放射免疫法检测血清T4、TRAb水平,流式细胞技术检测脾脏T细胞亚群(CD4、CD8、Treg、Th17细胞)的比例,分析化痰散结中药对T细胞亚群的影响。结果1.GD患者的中医证候特点GD患者的中医证候归纳为气滞痰凝证、心肝火旺证、阴虚内热证,其中气滞痰凝证13例(占43.3%),心肝火旺证10例(占33.3%),阴虚内热证7例(占23.3%)。2.各组免疫学指标2.1CD4、CD8、Treg、Th17细胞比例：正常组、GD甲功正常组和GD甲功异常组的全血CD4、CD8、Treg细胞比例相比,P>0.05,均无统计学意义。各组Th17细胞比例相比,GD甲功正常组(3.10±0.48)、GD甲功异常组(3.57±0.31)均明显高于正常组(2.25±0.30),P<0.01,具有统计学意义；GD甲功异常组高于GD甲功正常组,P<0.05,具有统计学意义。2.2Foxp3、RORyt的mRNA表达：正常组、GD甲功正常组和GD甲功异常组的Foxp3、RORγt的mRNA表达水平比较,P>0.05,均无统计学意义。2.3IL-10、IL-17水平：正常组、GD甲功正常组和GD甲功异常组的IL-10、IL-17水平比较,P>0.05,均无统计学意义。3.GD的中医证候与免疫学指标的关系气滞痰凝证与CD4、CD8、Treg、Th17、Foxp3、RORγt、IL-10、IL-17均无明显相关性,P>0.05,无统计学意义。心肝火旺证与CD8细胞比例呈负相关(β=0.509,P=0.008<0.05),具有统计学意义,但与CD4, Treg、Th17、Foxp3、 RORγt、IL-10、IL-17均无明显相关性,P>0.05,无统计学意义。阴虚内热证与CD8细胞比例呈正相关(β=0.440,P=0.039<0.05),具有统计学意义,但与CD4、Treg、Th17、Foxp3、RORyt、IL-10、IL-17均无明显相关性,P>0.05,无统计学意义。4.动物实验GD成模率达到61.7%。5.化痰散结中药对T4、TRAb的影响药物干预后,各组T4相比,中药大剂量组(95.72±20.86)、西药组(99.12±19.39)明显低于模型组(145.18±20.53),P<0.01,具有显著统计学差异；中药小剂量组(124.21±19.61)低于模型组,P<0.05,具有统计学差异。药物干预后,各组TRAb相比,中药大剂量组(15.6±7.43)、西药组(18.25±8.30)低于模型组(45.37±15.31),P<0.01,具有显著统计学差异；中药小剂量组(32.11±10.81)低于模型组,P<0.05,具有统计学差异。6.化痰散结中药对CD4、CD8、Treg、Th17细胞比例的影响药物干预后,小鼠脾脏的CD4、CD8、Treg、Th17细胞比例各组之间相比,P>0.05,均无统计学差异。结论1.分析GD患者的中医证候与细胞免疫的相关性,发现心肝火旺证与CD8细胞比例呈负相关,阴虚内热证与CD8细胞比例呈正相关,而上述两种证候与CD4、Treg、Th17、Foxp3、RORyt、IL-10、IL-17均无明显相关性；气滞痰凝证与上述免疫学指标均无明显相关性。2.用Ad-TSHR289重组腺病毒免疫BALB/c雌鼠可成功建立GD模型,该模型与GD的临床特征相似,成模率达到61.7%。3.化痰散结中药能有效降低GD小鼠的T4和TRAb水平,可能抑制甲状腺激素合成或分泌。4.化痰散结中药对T细胞亚群数量无明显影响,可能间接调节细胞免疫,有待进一步研究。