优雅蝈螽Gampsocleis gratiosa Brunner von Wattenwyl是直翅目Orthoptera重要的模式昆虫,易于饲养和取材,其精子形成过程已研究的较为清楚,这为探究肌球蛋白在优雅蝈螽顶体发生过程中的作用提供了条件。对于传统的模式动物,例如果蝇顶体发生过程已经有一些研究,但是对于直翅目昆虫而言,果蝇顶体发生的模型无法解决直翅目昆虫顶体发生过程中的一些问题,因此,探究优雅蝈螽顶体发生过程对于直翅目昆虫的研究提供了一个良好的参考,也为后续深入研究奠定基础。本实验室前期将优雅蝈螽成虫交给华大科技,使用Illumina Hiseq平台测得雌雄成体转录组数据,以此为依据建立了优雅蝈螽转录组数据库。本研究从优雅蝈螽成体转录组数据库中检索肌球蛋白基因序列,检索到的基因在NCBI上进行比对。根据比对结果,确定了GgMyo18a基因。结合优雅蝈螽差异转录组数据和GgMyo18a不同组织中表达量分析,本研究发现GgMyo18a基因在优雅蝈螽精巢中的表达量明显高于其他组织,推测Myosin 18A蛋白在优雅蝈螽顶体发生过程中发挥作用。本研究首先扩增了GgMyo18a基因,对扩增得到的开放阅读框序列进行生物信息学分析。然后设计干扰片段,进行RNAi试验,合成dsRNA进行体内注射,确定最佳干扰时间。结果发现,注射dsmyo18a之后,优雅蝈螽精巢中myo18a基因的mRNA表达量下调约79%,在第6天时,干扰效果最显著。最后选取干扰之后的优雅蝈螽,取其精巢组织做精子涂片,利用PAS染色技术、免疫荧光染色技术、石蜡切片技术、冰冻切片技术、透射电镜技术观察顶体发生各时期不同结构的变化。优雅蝈螽顶体发生过程中会发生核内物质重组与细胞核形变,微丝、微管重新组装等一系列变化。PAS染色用来观察顶体复合体中多糖类物质的变化,免疫荧光染色用来观察微管、微丝以及DAPI染色观察细胞核形态变化,透射电镜技术用来观察细胞器的变化,通过不同层次的观察探究优雅蝈螽Myosin 18A蛋白在精子顶体发生过程中的功能。结果表明,干扰之后的高尔基体结构从正常的带状变为紧凑的不规则状;原顶体表面从规则的圆球状变为表面不规则的凹凸状,原顶体中的多糖类物质从紧凑的球状分布变为松散的不规则状;顶体中微丝组装的结构出现“断裂”。综合分析干扰myo18a基因后的显微结构和超微结构的研究结果,总结如下:1.myo18a基因干扰之后的高尔基体从带状变为紧凑的不规则状,原顶体表面出现不规则变化。原顶体中多糖类物质的堆积受到影响。说明在顶体发生早期阶段,Myosin 18A蛋白可能参与了高尔基体正常形态的维持以及细胞核与原顶体之间的物质运输。2.由于微丝的组装受到影响,微丝参与形成的结构出现不同程度的“断裂”,说明Myosin 18A蛋白参与顶体发生过程中微丝的组装。总之,本研究认为Myosin 18A蛋白是一个比较特殊的肌球蛋白,不仅作为“货物马达”行使运输物质的功能,而且参与高尔基体形态的维持,通过影响高尔基体的正常形态间接影响顶体发生。