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研究背景:胸部常见疾病恶性胸腔积液（Malignant pleural effusion,MPE）由胸膜间皮瘤等原发性胸膜肿瘤产生,或由肺癌、乳腺癌、淋巴瘤等胸部肿瘤转移造成。非小细胞肺癌是MPE最常见的病因。MPE患者常预后不良,平均中位生存期不足一年。目前为止对MPE的管理没有统一的标准,除全身系统性治疗外,对胸膜腔进行干预已成为主流观点。免疫检查点分子程序性死亡受体1（Programmed death 1,PD-1）与其配体PD-L1结合后,激活下游通路,抑制淋巴细胞的增殖和活化,削弱机体抗肿瘤免疫应答,形成典型的肿瘤适应性免疫逃逸。以Nivolumab和Pembrolizumab为代表的Anti-PD1单抗已被广泛应用于临床抗癌治疗。然而,截止目前并没有临床研究或是病例报告使用免疫检查点抑制剂治疗肺癌伴MPE患者,尤其是在胸膜腔内进行局部注射治疗。胸腔内注射Anti-PD1对MPE的治疗作用及具体机制都有待探究。研究方法:1.培养LLC细胞株,构建MPE动物模型,通过CT观察不同时间点小鼠MPE量。记录胸腔内注射Anti-PD1单抗治疗组与对照组小鼠的生存期,观察两组胸腔积液量和癌肿结节个数,明确治疗效果。治疗过程中监测小鼠体重变化,测定肝酶和肌酐等生化指标,进行安全性评估。设置不同剂量Anti-PD1单抗,对比低剂量局部治疗组对MPE的控制情况。设置尾静脉注射给药组,观察局部治疗与系统治疗疗效和安全性差异。设置对侧胸腔注射治疗组,明确局部Anti-PD1单抗治疗对远处癌肿控制情况。2.通过免疫组化观察治疗组与对照组MPE模型鼠胸腔内癌肿处的CD8浸润情况。体外乳酸脱氢酶释放实验观察淋巴细胞是否参与杀伤肿瘤细胞。流式细胞术检测不同治疗组小鼠胸腔内癌肿结节及脾脏中CD4+T细胞、CD8+T细胞比例,明确局部CD8+T细胞参与Anti-PD1治疗MPE。流式细胞术检测CD8+T细胞活化标记物CD69,以及细胞因子IFN-γ、颗粒酶B等,对比不同治疗组CD8+T细胞活性及功能。建立“清除CD8”动物模型,重复以上实验,明确CD8+T细胞在Anti-PD1治疗MPE效应中的重要性。3.收集治疗组与对照组MPE模型鼠胸腔内肿瘤,进行组织RNA测序,筛选差异表达的基因,进行GO、KEGG、Reactome通路富集分析寻找差异通路。进行实时定量PCR检测癌肿处趋化因子和免疫相关基因的表达水平。酶联免疫吸附实验测定相关细胞因子释放水平。免疫组化和免疫印迹实验观察相关通路蛋白水平变化。4.回归临床,筛选符合入组条件的晚期非小细胞肺癌伴恶性胸腔积液患者,予以胸腔内注射人源性Anti-PD1单抗。分别在给药前、给药后5周和10周通过CT评估患者积液引流情况,评估安全性。流式细胞术测定患者接受局部治疗前后胸腔积液及外周血中淋巴细胞比例及相关分子表达情况,验证动物实验的结论。研究结果:1.在动物模型上证明了局部胸腔内注射Anti-PD1单抗对恶性胸腔积液具有治疗效果,明显减少积液量和癌肿结节个数,未观察到明显不良反应发生。低剂量免疫单抗局部治疗能够安全有效地控制MPE大量产生。局部治疗与系统治疗对MPE具有相似治疗效果。局部治疗能够控制远处癌肿生长。2.局部使用Anti-PD1单抗治疗MPE后使局部CD8浸润明显。体外验证在AntiPD1治疗下淋巴细胞参与杀伤肿瘤细胞。脾脏和癌肿处CD3+CD4+T细胞占比相对稳定。CD8+T细胞参与局部Anti-PD1治疗MPE。局部Anti-PD1治疗MPE能够改善局部CTL的活性及杀伤作用,增强局部免疫效应。3.组织RNA测序筛选出局部Anti-PD1治疗后明显上调包括趋化因子CCL20、CXCR5在内的大量免疫相关基因。GO等富集分析明确局部Anti-PD1治疗对局部免疫微环境中免疫相关的多条通路具有较大影响,包括趋化因子通路,淋巴细胞迁移、活化、增殖等。局部Anti-PD1治疗引起局部微环境中CCL20/CCR6通路活化。与淋巴细胞活化相关基因Tcf7、Lef1、CXCR5、BTLA在局部Anti-PD1治疗后明显上调,局部微环境中的Tfh和Tfc细胞可能受到影响。局部治疗后小鼠胸腔内CTL抗瘤反应增强,炎症因子TNF-α和IL-1β释放增加。局部Anti-PD1治疗明显抑制癌及癌旁PD-1/PD-L1通路。4.临床研究验证胸腔内注射人源性Anti-PD1单抗确实安全有效地治疗MPE,明显减少晚期NSCLC伴MPE患者积液量,5周胸膜闭锁率较高,不良反应发生较少。局部使用Anti-PD1单抗治疗患者MPE是通过改善患者胸腔内CTL的活性和杀伤功能。结论:1.动物模型中胸腔内注射Anti-PD1单抗对MPE具有治疗作用,安全性较好。低剂量局部治疗即可控制症状,与全身治疗获取同等疗效情况下安全性更佳,局部治疗有效控制远处癌肿。2.CD8+T细胞参与局部Anti-PD1治疗MPE。局部Anti-PD1治疗MPE可能通过提高局部CTL活性,增强CTL杀伤功能来发挥免疫效应。3.局部Anti-PD1治疗MPE引起局部微环境中CCL20/CCR6通路活化。局部Anti-PD1治疗后可能影响局部微环境中的Tfh和Tfc细胞活化。局部治疗后局部微环境中炎症水平增加。癌及癌旁PD-1/PD-L1通路治疗后受到抑制。4.胸腔内注射Anti-PD1单抗对临床NSCLC伴MPE患者的胸腔积液具有治疗作用,安全性尚可。局部Anti-PD1治疗患者MPE通过改善患者局部CTL的活性和杀伤功能。