研究背景肠易激综合征(Irritable Bowel Syndrome,IBS)是目前人类发病率最高的功能性肠道疾病,近年来越来越多的实验研究表明,IBS患者的肠道菌群结构发生了改变,主要表现为双歧杆菌、乳酸杆菌等益生菌数量减少,而大肠杆菌、肠球菌、梭状杆菌、链球菌等条件致病菌的数量增高。有研究发现IBS发病率与炎性因子水平具有明显的相关性:IBS患者促炎因子表现为升高趋势,抑炎因子呈现降低趋势,特别是血清IL-6、IL-18、IL-13。相关文献报道,肠道菌群结构的改变对肠道黏膜保护和细胞增殖有直接或间接的影响,从而诱发IBS。然而肠道菌群结构的失衡诱发IBS及IBS患者血清炎性因子水平改变的具体机制并不明确。最近有研究发现血清炎性细胞的改变与肠道菌群结构改变具有一定同步性,两者共同作用使人们免疫系统的抗病能力降低而导致肠炎的发生及肠道粘膜的损害。因此,我们认为IBS、肠道菌群、血清炎性细胞因子之间存在着密切的关系,但是它们之间存在着怎样的联系,目前研究并不明确。研究目的初步研究肠易激综合征患者肠道中菌群结构变化,血清细胞因子IL-6、IL-13、IL-18水平,通过探讨IBS、肠道菌群、血清细胞因子水平发现IBS可能的发病机制,从而为其治疗途径提供新的思路。研究方法(1)根据ROMEⅢIBS诊断标准,筛选与本次课题相关的IBS患者,病人来源于泰安市中心医院消化内一科;采用随机抽取方法筛选健康人群作为对照组,成员来自于泰安市市民;取两组人员新鲜晨便及空腹外周血血清作为实验标本。(2)通过人粪便基因组DNA提取试剂盒操作方法提取样本DNA。(3)通过Roche LightCycler?480Ⅱ实时荧光定量PCR检测不同肠道细菌的循环阈值(即Ct值),根据标准曲线方程得出各菌群拷贝数(单位:copies/ul)。(4)以酶联免疫吸附试验(ELISA)方法检测目标人群外周血血清中促炎因子IL-6、IL-18及抑炎因子IL-13的浓度。按照相关试剂盒说明进行操作。(5)运用GraphPad Prism 5.0统计软件对所得各肠道菌群拷贝数量及细胞因子含量进行TTEST检验分析;运用Microsoft Excel-2003、spss20.0统计软件对存在较大差异性的肠道细菌和细胞因子进行两者之间的相关性分析。结果1、根据ROMEⅢIBS诊断标准,筛选与本次课题相关的IBS患者39例,男女比例2:3,平均年龄51.86岁;健康对照组人群共28例,男女比例:2:3,平均年龄34.23岁。2、重组后的质粒经过普通PCR扩增后所得到的条带显示目的基因片段大小与人粪便总肠道菌群扩增产物大小一致,各待测细菌标准曲线的有效率在1.958-2.105之间。说明本实验成功构建了重组质粒。3、采用重组质粒作为定量参考成功检测到了总肠道菌群、大肠杆菌、乳杆菌、肠球菌、拟杆菌门菌、拟杆菌、产气荚膜杆菌、硬壁菌门菌、双歧杆菌的拷贝数量。IBS患者肠道各菌群数量与正常对照组相较:总肠道菌群数量降低;大肠杆菌、肠球菌平均拷贝数量明显增加(p<0.01),有统计学意义;硬壁菌门菌、拟杆菌门菌、双歧杆菌、拟杆菌数量降低(p<0.05),有统计学意义;产气荚膜杆菌平均拷贝数量升高,但p>0.05,无统计学意义;乳杆菌平均拷贝数量显著降低,但p>0.05,无统计学意义;在总肠道菌群中硬壁菌门菌与拟杆菌门菌所占比例最大,表现为健康对照组与患者组硬壁菌门菌占总肠道菌群比例分别为34%、22%,拟杆菌门分别为59%、36%;其次为大肠杆菌,在对照组中所占比例几乎为0%,而在IBS患者中比例升高为1%。4、炎性细胞因子IL-6、IL-13、IL-18在IBS患者血清中的表达:IBS患者血清促炎因子IL-6、IL-18浓度明显高于正常对照组(p<0.01),有统计学意义;IBS患者IL-13平均浓度较正常组有所降低,但是p>0.05,无统计学意义。5、通过统计学分析可以发现:大肠杆菌拷贝数量与IL-6、IL-18含量呈现明显的正相关性(γ>0),与IL-13呈现负相关性(γ<0);拟杆菌门菌、硬壁菌门菌与IL-6、IL-18呈现明显的负相关性(γ<0),与IL-13呈现明显的正相关(γ>0)。结论1.肠易激综合征发病与肠道菌群结构改变有关,总体上表现为益生菌群数量降低,条件致病菌数量增加,有害菌群数量升高;2.促炎因子IL-6、IL-18在IBS患者血清表达升高,提示存在免疫激活;而抑炎因子IL-13水平变化与健康对照组比较无明显差别;3.肠易激综合征患者肠道中改变的菌群结构或其代谢物质与血清炎性细胞因子之间存在明显的相关性,大肠杆菌、拟杆菌门菌和硬壁菌门菌在IBS的免疫激活过程中发挥了重要作用;4.IBS患者的菌群结构及炎性细胞因子水平为临床治疗的研究提供新思路。