前言液基细胞学检测系统通过祛除标本内的粘液、杂质及炎性细胞,制成视野清晰的薄层涂片,在宫颈细胞学诊断上已得到了细胞学工作者的一致认可。该法是否可以应用于纤支镜刷检细胞学检查以及在纤支镜刷检细胞学诊断中意义如何,目前国内外尚未见报道。随着分子生物学技术的发展,越来越多的技术被应用于肿瘤遗传学研究。其中安全、快速、稳定、敏感的荧光原位杂交技术逐渐成为研究肿瘤细胞染色体改变的重要手段。本研究利用LCT和FISH技术,对142例纤维支气管镜刷检标本进行了研究,以期探讨纤维支气管镜刷检标本应用LCT和FISH技术对肺癌的早期诊断的意义。材料与方法1、研究对象及标本的采集收集中国医科大学附属一院2008年2月—10月术前纤维支气管镜刷检标本142例。其中102例肺癌、40例肺良性病变。2、标本的处理将刷检标本用传统涂片方法涂2张,巴氏染色。余下部分倒入含有CytoRich保存液的小瓶中,每一体积气管镜刷检标本混合相同体积的CytoRich保存液;每10mL加入1mL粘液溶解液,混合后放置30min,震荡器上震动10s,如混合液中仍有凝结,可再增加一些粘液溶解液,直至粘液溶解。3、LCT的制备将溶解后的标本倒入50mL的离心管中,按2000r/min离心10min,离心后去上清,加去离子水至7.5mL,重新震荡混匀,按上述标准再离心5 min,弃上清,震荡离心管,放在AutoCyte机器上制片、染色。4、FISH方法TERC基因检测(1)探针:TERC探针由北京金菩嘉医疗科技有限公司提供,为TERC/CPS3 DNA探针;(2)涂片预处理:将玻片置于2×SSC(pH=7.0)溶液中5min×2,0.1mol/L HCL10min,0.01 mol/LHCL和胃蛋白酶粉末的混合液10min,室温下2×SSC(pH=7.0)漂洗5min×2,70%、85%和100%乙醇梯度脱水固定,自然干燥;(3)FISH操作步骤:避光环境中,玻片置于77℃70%甲酰胺和2×SSC的变性液中浸泡5min,用-20℃预冷的70%、85%和100%乙醇梯度脱水各3min,玻片自然干燥,置于45-50℃烤片机预热后与探针杂交。探针混合液(7μl杂交缓冲液,1μ1去离子水,2μl探针),77℃水浴变性5min,置于45-50℃水浴箱中,杂交前取出,将变性后的探针混合物滴于玻片杂交区域,加盖盖玻片,橡皮胶封边,42℃保温箱中过夜杂交。次日玻片洗涤:移去盖玻片,46℃下玻片置于70%甲酰胺和2×SSC混合溶液,10min×3,再置于2×SSC溶液10min,最后置于2×SSC/0.1%NP-40混合液中5min,70%乙醇浸泡3min。玻片暗处自然干燥后加15μl DAPI复染剂,暗处放置20min。5、FISH信号的判断用OLYMPUSB×51荧光显微镜在DAPI/FIFC/Texas Red三色滤光镜激发下观察间期细胞荧光杂交信号,用VideoTest公司提供的FISH分析软件分析图像,评估整个涂片的CPS3和TERC基因双色探针杂交情况。至少计数信号完整的100个细胞,20个(占20%)细胞有TERC拷贝数增加为阳性。统计异常信号细胞的百分率。按观察到的信号数记录为:CPS3信号数,TERC信号数,二倍体记录为2:2,TERC异常信号的各种类型记录为2:3,2:4,2:5,2:6。6、分析与统计应用SPSS11.5软件进行统计分析,比较各方法之间差异,采用X~2检验,检验标准α=0.05。结果1、LCT、传统细胞学及LCT+传统细胞学敏感度比较传统细胞学涂片由于受粘液丝、炎性细胞及坏死细胞碎屑的干扰,102例肺癌中仅有69例发现了癌细胞,敏感度仅为67.6%(69/102);而LCT法图片背景干净、细胞图像清晰,其敏感度达82.4%(84/102);两者之间有统计学意义(P＜0.05)。但两者联合应用,其敏感度高达88.2%。与传统细胞学相比,差异有统计学意义(P＜0.01)。2、FISH与LCTFISH单独应用于肺癌的诊断与LCT细胞学相比两者之间没有差异(85.4%VS72.0%,P＞0.05),在确诊的102例肺癌标本中,FISH诊断出88例,LCT细胞学诊断出84例。两组方法之间无统计学意义(x~2=0.59,P＞0.05)。但FISH对肺鳞癌诊断的敏感度较高(51/52,98.1%)。3、FISH与活检FISH单独应用于肺癌的诊断敏感度高于活检(86.3%VS 63.7%,P＜0.01),在确诊的102例肺癌标本中,FISH诊断出88例,活检出65例。两组方法之间存在显著差异(x~2=13.83,P＜0.01)。4、传统细胞学、LCT、活检、FISH与术后组织学142例气管镜刷检样本中通过术后组织学确诊为肺癌的102例,良性病变40例。经传统细胞学检查为阳性的69例病例;经LCT细胞学检查为阳性的病例为90例,其中术后组织学诊断为肺癌的84例,良性病变6例;经活检为阳性的65例病例;经FISH检查为阳性的96例病例,其中术后组织学诊断为肺癌的88例,良性病变8例。本实验中,传统细胞学诊断敏感度为67.6%,特异度为100%,准确度为76.8%;LCT细胞学诊断的敏感度为82.4%,特异度为85.0%,准确度为83.1%;活检诊断的敏感度为63.7%,特异度为100%,准确度为73.9%;FISH诊断的敏感性为86.3%,特异度为80.0%,准确度为84.5%。讨论LCT在纤维支气管镜刷检肺癌细胞诊断的敏感度高于传统细胞学,它可以用于临床纤支镜细胞学诊断,是肺癌早期诊断不可忽略的手段之一。应用LCT检出肺腺癌17例,其中7例经传统细胞学检查为阴性;应用传统细胞学检出肺腺癌12例,其中2例标本经传统细胞学检测为阳性,而LCT检测为阴性。尽管二种方法在肺腺癌的检测中无明显统计学意义,但二者联合应用后敏感度较单独应用传统细胞学方法显著增高(88.2%Vs 67.6%,P＜0.05)。传统细胞学检出鳞癌阳性例数41例,而应用LCT后阳性诊断例数仅为42例。分析其原因,可能与我们每例标本只制作一张LCT薄片有关。LCT法相对于传统细胞学的优点是:1、涂片背景干净:红细胞大多破坏消失,粘液丝溶解,炎性细胞数量明显减少,异常细胞显而易见,阳性细胞不易漏诊;2、细胞图像清晰,层次分明:核膜、核仁及染色质等细微结构清晰可见;3、有效上皮细胞成分在自动程序控制下,自然沉落到赋予细胞粘附液的载玻片上,无人为涂抹、牵拉和挤压,故细胞的三维立体感明显,并多存在原有组织的特有结构。本研究还显示,FISH对于肺癌刷检标本检测的敏感度的要比传统细胞学及活检更高。FISH敏感性较高,应用于肺癌刷检液基细胞标本的诊断更具优势。但本研究中发现2例患者LCT检测阳性而FISH表达阴性的标本。可见,对于肺癌刷检标本的检测,FISH和LCT可以互为补充,以提高诊断效率。FISH与活检相比敏感度更高可能与活检取材的局限性有关。对于FISH来说,它可以检测有恶变倾向细胞染色体的特点决定即便仅少量的恶变组织仍可得到阳性结果。另外我们发现利用LCT处理之后的标本做FISH检查,既可以降低炎细胞对实验的影响,又可以节省试剂用量,降低FISH检测成本。本实验研究结果显示应用FISH技术检测肺鳞癌其敏感度可以达到98.1%,与LCT相比具有显著统计学差异(P＜0.01);而在腺癌、小细胞癌的诊断中两种方法无显著差异,这可能也与腺癌、小细胞癌病例数较少有关。本实验102例恶性标本中,88例经支气管镜刷检标本的FISH分析结果恶性,说明这些标本存在染色体的改变。而FISH诊断为恶性,组织学诊断为良性的8例标本中,5例为上皮中重度异型增生,2例为结核,1例为炎性假瘤。其中的5例上皮中重度异型增生,提示我们可能存在肺癌的癌前期病变,在其细胞或组织形态学改变之前可能在基因水平就已经发生改变。在传统细胞学、LCT和活检阴性的标本中,FISH同样能够发现标志着恶性肿瘤存在的异倍体。若FISH结果为阳性而细胞学和(或)活检结果不支持的患者,应予以密切随访观察。综上所述,LCT及FISH对于肺癌的诊断敏感性优于传统细胞学检查,可以应用于肺癌诊断,提高诊断效率,同时,FISH对肺癌的发生可能起到一定的预测作用,是肺癌诊断不可忽略的手段。结论1、应用LCT检测小细胞癌敏感度优于传统细胞学检查。二者联合应用后敏感度较单独应用传统细胞学方法显著增高。2、应用FISH检测肺鳞癌的敏感度较高。3、FISH对肺癌的发生可能起到一定的预测作用。