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哺乳动物合子基因组激活（Zygotic genome activation,ZGA）过程中合成大量新蛋白,接替母源物质调控早期胚胎发育。体细胞核移植（Somatic cell nuclear transfer,SCNT）胚胎发育过程中,合子基因组激活异常,导致核移植胚胎发育阻滞在ZGA时期。研究表明长链非编码RNA（Long noncoding RNA,lncRNA）参与调控合子基因组激活。但山羊胚胎ZGA时期尚不明确,lncRNA保守性较差,同时lncRNA参与调控核移植胚胎重编程的研究也鲜有报道。因此,本研究以山羊胚胎为试验材料,探究lncRNA调控山羊ZGA期核移植胚胎重编程的机制。本研究主要分为以下四部分:试验一、山羊ZGA期差异表达mRNA和lncRNA的研究本试验旨在确定山羊合子基因组激活期,并筛选鉴定影响山羊合子基因组激活的mRNA和lncRNA。首先,利用体外培养试验和免疫荧光的方法确定山羊合子基因组激活期。其次,使用单细胞转录组测序技术分析山羊ZGA过程中mRNA和lncRNA的表达变化。最后,利用显微注射siRNA（Smallinterfering RNA）的方法研究干扰lncRNA对山羊早期胚胎发育的影响。结果显示:（1）在体外培养试验和20 μg/ml α-鹅膏菌素（α-amanitin）处理试验中,山羊胚胎出现8细胞期阻滞现象;同时,RNA聚合酶Ⅱ在8细胞期胚胎中高表达。（2）与4细胞期胚胎相比,8细胞期胚胎中有800个mRNA和250个lncRNA差异表达。（3）差异表达mRNAKdm4d与H3K9me3有关,在8细胞期胚胎中表达水平显著升高;H3K9me3在山羊胚胎ZGA过程中动态变化,在8细胞期胚胎中几乎不表达,但在发育阻滞的8细胞期胚胎中高表达。（4）差异表达lncRNA lnc1178、lnc137和lnc3263均靶向作用于多个差异表达的转录因子,因此选作功能性lncRNA;分别干扰lnc1178、lnc137和lnc3263在山羊合子中的表达,发现干扰lnc137的山羊胚胎中,嚢胚率显著降低（19.4±0.44%Vs.75±2.89%,P<0.01）。（5）干扰lnc137显著降低8细胞胚胎中合子基因CXCL6、EIF-1A和HSP70.1的表达水平（P<0.01）,并上调母源基因GDF9（P<0.01）的表达水平。以上结果表明,山羊合子基因组激活发生在8细胞期;在山羊合子基因组激活过程中,mRNA和lncRNA动态变化;LncRNA lnc137可能通过促进母源基因降解和合子基因表达,影响山羊早期胚胎发育。试验二、山羊核移植胚胎ZGA期差异表达mRNA的研究SCNT胚胎中普遍存在异常的合子基因组激活。因此,本试验利用单细胞转录组测序技术分析山羊核移植胚胎ZGA期mRNA的表达变化。其次,分析组蛋白甲基化修饰相关基因和组蛋白修饰H3K4me3在核移植胚胎发育过程中的变化。最后,利用显微注射技术分析差异表达mRNA对核移植胚胎体外发育的影响。结果显示:（1）与8细胞期单精子胞质注射（Intracytoplasmic sperm injection,ICSI）胚胎相比,8细胞期核移植胚胎中,813个mRNA表达水平显著升高,235个mRNA表达水平显著降低。（2）H3K4me3去甲基化基因Kdm5a（P<0.01）和Kd5b（P<0.05）在8细胞期山羊核移植胚胎中表达水平显著降低。（3）组蛋白甲基化修饰H3K4me3在山羊ICSI胚胎合子基因组激活过程中逐渐降低,在ICSI囊胚中消失,但在8细胞期核移植胚胎中H3K4me3修饰水平仍然较高。（4）注射Kdm5b mRNA可有效移除8细胞期核移植胚胎中的H3K4me3修饰,并显著提高山羊核移植胚胎囊胚率（47.91±0.86%Vs.17.67±3.1%,P<0.01）;干扰Kdm5b导致8细胞期核移植胚胎中H3K4me3水平仍然较高,核移植胚胎发育受阻。以上结果表明,山羊核移植胚胎合子基因组激活异常,且存在异常高水平的H3K4me3修饰;Kdm5b可促进体细胞核移植胚胎重编程。本试验为探究体细胞核移植胚胎重编程机制及提高山羊核移植胚胎体外发育能力提供了理论参考。试验三、LncRNA调控山羊核移植胚胎重编程的研究LncRNA参与调控哺乳动物早期胚胎发育,但其对核移植胚胎重编程的作用鲜有报道。因此,本试验旨在筛选影响山羊核移植胚胎合子基因组激活期重编程的lncRNA,并阐述其调控核移植胚胎重编程的潜在机制。首先,利用单细胞转录组测序技术筛选山羊核移植胚胎合子基因组激活过程中差异表达的lncRNA。其次,以Kdm5b作为靶基因筛选功能性lncRNA,并初步验证Kdm5b和靶基因关系。最后,利用显微注射技术研究lncRNA对山羊核移植胚胎早期发育的影响,并阐述其影响核移植胚胎重编程的机制。结果显示:（1）与4细胞期核移植胚胎相比,8细胞期核移植胚胎中共有159个lncRNA差异表达,其中131个lncRNA表达水平显著升高,28个lncRNA表达水平显著降低。（2）以Kdm5b作为靶基因,筛选得到18个候选lncRNA,其中lnc3712受Kdm5b影响最为显著,因此选择lnc3712进行后续研究。（3）干扰lnc3712的山羊核移植胚胎,囊胚率显著升高（45.94±1.3%Vs.17.67±3.1%,P<0.01）。（4）在干扰lnc3712的8细胞期山羊核移植胚胎中,700个mRNA表达水平升高,其中合子基因BTG3、UBE2M、UBE2S、EIF3G、BTG1和HSFl等表达水平显著升高（P<0.05）;同时,转录因子ABTB1、GATA2和TEAD4等表达水平显著升高（P<0.01）,而母源基因WEE2和GDF9表达水平显著降低（P<0.01）。（5）干扰lnc3712的8细胞期山羊核移植胚胎中,Kdm5b表达水平显著升高（P<0.05）,组蛋白甲基化修饰H3K4me3消失;同时,在干扰lnc3712的核移植胚胎囊胚期H3K27me3重新出现。以上结果表明,lncRNA在山羊核移植胚胎合子基因组激活过程中动态变化;干扰lnc 3712可促进合子基因表达和基因组转录,并促进Kdm5b表达,提高体细胞核移植胚胎重编程效率。本试验鉴定得到一个参与调控山羊核移植重编程的新lncRNA,丰富了 lncRNA调控核移植重编程的研究内容,同时为研究lncRNA调控核移植重编程提供了理论依据。试验四、核移植胚胎及克隆山羊Xist启动子甲基化状态的研究LncRNA Xist对XCI的建立极为重要,但山羊基因组中Xist序列未知,而且有关Xist的研究在克隆山羊中也鲜有报道。因此,本试验分析ZGA期核移植胚胎和克隆山羊耳、肺脏和脑组织中Xist表达水平及启动子甲基化状态的变化。首先,本研究扩增了山羊Xist基因的启动子序列,并利用MethPrimer预测其差异甲基化区域（Differentially methylated region,DMR）。其次,利用亚硫酸盐测序（Bisulfite sequencing PCR,BSP）分析ZGA期山羊核移植胚胎及死亡克隆山羊耳、肺脏和脑组织中Xist启动子甲基化水平并利用荧光定量PCR分析Xist及X染色体相关基因的表达水平。结果显示:（1）预测的XistDMR在精子、卵母细胞、雌性成纤维细胞和雄性肺脏组织中甲基化水平不同,是差异甲基化区域。（2）在山羊8细胞期核移植胚胎中,Xist甲基化水平显著高于ICSI同时期胚胎。（3）在雌性死亡克隆山羊耳、肺脏和脑组织中,Xist启动子甲基化水平显著升高（P<0.01）。但在雄性死亡克隆山羊耳、肺脏和脑组织中及存活克隆山羊耳组织中,Xist DMR甲基化水平无显著改变。（4）在山羊8细胞期核移植胚胎中,Xist表达水平无显著差异,但在雌性死亡克隆山羊耳、肺脏和脑组织中,Xist表达水平显著降低（P<0.01）。以上结果表明,山羊核移植胚胎ZGA期和雌性死亡克隆山羊中Xist甲基化水平异常升高。通过以上试验,本研究证实了山羊ZGA发生在8细胞期。在山羊胚胎ZGA过程中,800个mRNA和250个lncRNA差异表达,干扰lnc137影响山羊早期胚胎发育。在山羊核移植胚胎发育过程中,合子基因组激活异常。过表达Kdm5b或干扰lnc3712均显著提高核移植胚胎体外发育能力;特别是lnc3712可能通过Kdm5b调控山羊核移植胚胎重编程。本研究丰富了 lncRNA调控核移植重编程的研究内容,同时为探究体细胞核移植重编程机制及提高山羊核移植胚胎体外发育能力提供了理论参考。