赖氨酰氧化酶是一种细胞外铜依赖的氨基酸氧化酶。在人和多种动物中,赖氨酰氧化酶能促进胶原和弹性蛋白的交联,这两种胶原是主要的细胞外基质结构蛋白。LOXL3是赖氨酰氧化酶(Lysyl oxidase,LOX)家族成员之一。本实验室的前期工作表明,Loxl3基因全身性敲除的小鼠,纯合小鼠在围产期死亡,并且伴有严重的腭裂,脊柱畸形,肺容量和重量减少,囊状空间缩小以及胸腔变形且变小等表型。但对于Loxl3敲除小鼠腭裂的机制目前仍不清楚。基于以上研究结果,本课题试图揭示Loxl3敲除小鼠腭裂的机制,希望能对腭裂的临床治疗提供理论依据。首先我们通过石蜡切片及HE染色,确定了Loxl3敲除小鼠在胚胎期14天开始腭突上抬延迟,从而使得腭突不能完全融合,最终导致了腭裂。并且免疫荧光结果显示,胚胎期14天小鼠,Loxl3在腭突部位表达。我们通过阿利新蓝染色检测了 Loxl3敲除小鼠胚胎期14天腭突透明质酸的表达情况,发现并无异常,同时我们通过Brdu检测了Loxl3敲除小鼠在同时期腭突细胞增殖情况,发现腭突细胞增殖减少,因此我们初步得出结论Loxl3敲除小鼠腭突抬升延迟是由于细胞增殖的减少。我们通过qPCR检测了一系列腭突发育相关基因在RNA水平的变化,发现Shh及其下游基因Osr2在RNA水平降低,原位杂交的结果更直观的反映了这个问题。我们又通过Western Blot检测了 SHH及OSR2蛋白水平的变化,发现同qPCR结果相吻合,SHH和OSR2在蛋白水平也降低。我们用中性蛋白酶Ⅱ将腭突的上皮细胞和间充质细胞分开培养,通过qPCR分别检测上皮细胞中的Shh及间充质细胞中的Osr2的RNA水平,发现在Loxl3敲除小鼠上皮和间充质细胞中,Shh和Osr2在RNA水平降低,通过Western Blot检测上皮细胞中SHH及间充质细胞中OSR2的蛋白水平,发现结果与qPCR的结果相吻合。我们发现在Loxl3敲除小鼠间充质细胞中,羟脯氨酸含量降低。因此我们得出结论,Loxl3敲除后使胶原含量减少,Shh表达降低,从而使得下游基因Osr2表达降低,Osr2的降低导致了细胞增殖减少,腭突上抬延迟,最终未能完成融合,导致了腭裂的表型。