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背景多发性硬化(Multiple sclerosis,MS)是炎症性脱髓鞘疾病,发生在中枢神经系统(Central nervous system,CNS),是青壮年比较常见的非创伤性神经系统性疾病。氧化应激、线粒体功能障碍是MS疾病进展、组织损伤和脱髓鞘最为主要的原因。树突状细胞(Dendritic cells,DC)为最主要的抗原提呈细胞。其捕获抗原,提呈给T细胞,然后启动T细胞的免疫应答。DC调节CD4+T细胞分化,并对CNS自身免疫反应及外周免疫发挥耐受与监控的作用,DC向CNS的迁移和激活是MS发病机制中的一个关键因素。Tfam是一个编码线粒体转录因子A(TFAM,mitochondrial transcription factor A)的核基因,它既稳定线粒体DNA(Mitochondria DNA,mt DNA)又启动了mt DNA复制,调控氧化应激反应和线粒体正常功能。TFAM可激活DC细胞的亚群,放大Toll样受体9(Toll Like Receptor 9,TLR9)信号,并触发促炎的细胞因子的释放。mt DNA被证明是由TLR9感应并促进全身的炎症及器官损伤,TFAM增强了Cp G DNA诱导的浆细胞样树突状细胞(plasmacytoid dendritic cells,p DC)的活化,导致肿瘤坏死因子的释放增加,从而促进T细胞抗原特异性的免疫应答。据研究表明,间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)具有抗氧化特性,能够靶向线粒体功能障碍,MSCs移植的细胞治疗改善了MS发生发展,增加了线粒体生物发生,转录物过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活因子1(peroxisome proliferator‐activated receptor gamma‐coactivator 1,PGC-1a)和TFAM的表达水平上调。研究发现,TFAM对调节性T细胞(Regulatory T cells,Treg)的功能至关重要。表达Foxp3的Treg细胞能够抑制常规T细胞反应,建立自身耐受性,以防止自身免疫,并维持组织的稳态。Foxp3缺乏会导致Treg细胞的发育和功能不正常,导致自身免疫性疾病的发生,Tfamfl/flFoxp3cre小鼠出现了严重的炎症性疾病,如小鼠体型变小、皮肤出现炎症、脱发等,早期致死率较高,因此,Tfam敲除的Treg细胞导致免疫稳态的改变与自身免疫的发展。目前对于TFAM的表达如何影响DC的功能研究甚少,TFAM在MS中的作用还不明确,本课题应用Tfam敲除的CD11c+DC来观察实验性自身免疫性脑脊髓炎(Experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)的发生和发展,从而阐明这些问题,我们建立了Tfamfl/flCD11ccre小鼠,构建EAE模型,在此模型中Tfam特异性地在DC(TfamDC-KO)中敲除,借此我们研究TfamDC-KO对CD4+T细胞分化及EAE发生发展的影响。目的本研究通过构建Tfamfl/flCD11ccre小鼠,通过m RNA测序GO、KEGG富集分析,找到CD11c+DC中Tfam基因特异性敲除富集到的信号通路,为探讨Tfam调节CD11c+DC的免疫功能提供了相关的分子机制基础。研究EAE模型中TfamDC-KO对CD4+T细胞分化及EAE发生发展的影响,在转录水平层面通过m RNA测序GO、KEGG富集分析,找到EAE模型TfamDC-KO对CD4+T细胞分化富集的信号通路及相关差异表达基因。材料与方法首先,利用条件性基因敲除技术,设计和构建打靶载体和基于Cre-lox P重组酶系统来建立表达CD11c特异性敲除Tfam基因的小鼠模型即Tfamfl/flCD11ccre小鼠。我们取Tfamfl/flCD11ccre小鼠和Tfamfl/fl小鼠脾脏组织研磨成单细胞悬液并用流式细胞仪检测两组小鼠CD11c+DC细胞比例并进行分型,分为p DC(CD11c+CD317+)、常规树突状细胞(conventional DC,c DC)(CD11c+MHCⅡ+),并检测DC成熟度标志物CD80、CD86。用Trizol法抽提CD11c+DC的RNA,通过m RNA转录组测序检测CD11c+DC基因表达谱。用生物信息学方法比较两组细胞间的显著差异表达基因(Differentially expressed genes,DEGs),通过GO、KEGG富集分析差异表达蛋白质编码基因功能。我们通过对Tfamfl/flCD11ccre小鼠和Tfamfl/fl小鼠皮下注射含MOG35-55肽段的CFA,在当天及48小时后对小鼠腹腔注射PTX溶液以建立EAE疾病模型。在用MOG35-55肽段免疫小鼠后的第18天,此时的小鼠处于发病高峰期。在高峰期时,用流式细胞仪检测两组小鼠CD11c+DC细胞比例并进行分型,分为p DC、c DC,并检测DC成熟度标记物CD80、CD86。同时检测小鼠脾脏组织CD4+T细胞亚群TH1、TH17、滤泡辅助性T细胞(Follicular helper T cell,Tfh)、Treg的分化情况。同时用q PCR法检测小鼠腹股沟淋巴结细胞因子相关基因IFN-γ、IL-10、IL-17A、Tbet的表达同时用流式细胞术检测Treg细胞的分化情况。利用磁珠分选试剂盒分选MOG35-55免疫后第12天小鼠脾脏的CD11c+细胞,用Trizol法抽提CD11c+DC的RNA,利用m RNA转录组测序检测CD11c+DC基因表达谱,通过生物信息学方法比较两组细胞间的DEGs。通过GO、KEGG富集分析差异表达蛋白质编码基因功能。结果(1)Tfamfl/flCD11ccre小鼠和Tfamfl/fl小鼠在稳态下的脾脏组织中DC细胞比例没有显著性差异,p DC、c DC细胞比例没有显著性差异(p>0.05);(2)CD11c+DC上Tfam基因敲除加重EAE疾病的发展;(3)MOG35-55肽段免疫小鼠Tfamfl/flCD11ccre小鼠脾脏组织中DC细胞比例较Tfamfl/fl小鼠增加,且p DC、c DC细胞比例显著性上调(p<0.05);(4)MOG35-55肽段免疫小鼠后,Tfamfl/flCD11ccre小鼠诱导CD4+T细胞分化为TH1/TH17细胞,抑制CD4+T细胞分化向Treg细胞分化;(5)在转录本水平层面分析MOG35-55肽段免疫小鼠脾脏组织CD11c+DC的DEGs,发现差异表达的m RNA分布在与CD4+T细胞分化、TH1、TH2免疫调节反应细胞因子调节免疫反应等有关的信号通路中。结论我们的结果揭示了Tfamfl/flCD11ccre小鼠和Tfamfl/fl小鼠在稳态下的脾脏组织中DC细胞比例没有显著性差异,p DC、c DC细胞比例没有显著性差异,但用MOG35-55肽段免疫小鼠,Tfamfl/flCD11ccre小鼠较Tfamfl/fl小鼠DC细胞比例增加,且p DC、c DC表达显著性上调,且证实了TfamDC-KO加重EAE的进展,Tfamfl/flCD11ccre小鼠诱导CD4+T细胞分化为TH1/TH17细胞,抑制CD4+T细胞向Treg细胞分化。本研究通过GO富集分析也阐明了Tfamfl/flCD11ccre小鼠DC能够影响CD4+T细胞的分化、TH1、TH2免疫调节反应和细胞因子调节免疫反应等信号通路,说明Tfam在DC上的表达与脑脊髓炎特异性CD4+T细胞的分化以及MS的发生发展相关联。