【研究背景】肾结石作为泌尿外科最常见的疾病之一,严重影响着患者的身心健康及生活质量。根据一项覆盖全国的尿石症横断面调查结果,我国成年人肾结石发病率高达5.8%。典型的肾结石发作时患者可出现肾绞痛、血尿、发热及呕吐等一系列症状,更甚者还表现为反复尿路感染和尿路梗阻,最终进展为肾衰竭。草酸钙结石作为肾结石中占比最高的类型,主要由高草酸尿这一代谢因素引起。为此探究草酸钙肾结石发生的病因和分子机制,寻找新的干预靶点,将成为结石防治过程中重要的里程碑事件。关于草酸钙结石的形成机制众说纷纭,近年来研究发现炎症通路的关键组分之一,NLRP3炎症小体也参与了泌尿系结石发生的调控过程。既往文献表明在继发性高草酸尿症模型中,草酸钙晶体可以激活肾脏炎症小体表达,引起肾脏局部微环境病变最终导致肾功能破坏,提示NLRP3炎症小体可能在草酸钙结石的疾病进展中发挥着重要作用。课题组前期研究发现在乙二醇诱导的继发性高草酸尿症大鼠模型中,氯喹能够明显抑制大鼠肾脏的炎性损伤并改善大鼠肾功能,但其具体分子机制仍不清楚。既往的研究也发现NLRP3炎症小体在高草酸/草酸钙晶体诱导的肾脏炎症损伤及晶体沉积的过程中发挥了重要作用,但氯喹是否可以通过抑制NLRP3炎症小体活化从而抑制结石肾脏晶体沉积仍需进一步的研究和验证。【研究目的】证实并揭示氯喹通过抑制NLRP3炎症小体活化拮抗继发性高草酸尿症大鼠肾损伤和草酸钙晶体沉积的作用和分子机制。【研究方法】体内实验:通过乙二醇+氯化铵法构建继发性高草酸尿症大鼠模型,同时灌胃氯喹进行药物干预,构建对照组、乙二醇模型组、氯喹干预组。通过HE染色、Masson染色、Pizzolate染色、免疫组化等对肾脏组织切片进行染色,检测肾脏草酸钙晶体沉积情况、炎性损伤情况及NLRP3炎症小体活化情况,检测氯喹干预对继发性高草酸尿症大鼠肾脏晶体沉积的影响。体外实验:通过LPS及COM晶体联合刺激诱导BMDMs/THP-1巨噬细胞,同时氯喹预处理进行药物干预,构建对照组、氯喹组、脂多糖和草酸钙联合刺激组及氯喹干预组四个组。通过Western Blot检测巨噬细胞的NLRP3炎症小体活化情况及相关蛋白表达;通过ELISA检测细胞培养上清液炎症细胞因子含量,检测氯喹干预对COM诱导的NLRP3炎症小体活化的影响。【研究结果】1.氯喹显著抑制乙二醇诱导的继发性高草酸尿症大鼠肾脏晶体沉积HE染色、Pizzolate染色及偏光显微镜结果显示:与对照组相比,乙二醇模型组大鼠肾脏微观结构破坏严重、晶体沉积明显,而氯喹干预显著改善了乙二醇诱导的继发性高草酸尿症大鼠肾脏晶体沉积。2.氯喹显著抑制继发性高草酸尿症大鼠肾脏炎性损伤和纤维化Masson染色结果显示:与对照组相比,乙二醇模型组大鼠肾脏视野下大范围胶原纤维蓝染,而氯喹干预显著减轻了肾脏的纤维化。免疫组化结果显示:乙二醇模型组的炎症指标MCP-1、OPN、IL-1β都明显高表达,而氯喹的干预则明显拮抗上述炎症指标的上调。3.氯喹显著抑制NLRP3炎症小体的活化IHC结果显示:相较于对照组,乙二醇模型组的肾组织NLRP3、ASC、Caspase1、GSDMD和Cathepsin B的蛋白表达显著上调,而氯喹干预则可以明显抑制上述蛋白的表达上调,提示氯喹干预可以抑制乙二醇诱导的NLRP3炎症小体活化。细胞实验结果显示:LPS与COM的联合刺激可以显著激活BMDMs细胞炎症小体,且促进IL-1β和IL-18的分泌,而在氯喹干预可以明显抑制炎症小体活化,并显著减少IL-1β、IL-18的分泌量。但THP-1细胞中GSDMD和Cathepsin B的表达未见明显差异。4.氯喹通过NF-k B信号通路抑制NLRP3炎症小体的活化IHC结果显示:与对照组相比,乙二醇模型组大鼠肾脏的NF-k B的磷酸化及核定位明显增加,而氯喹干预可以显著拮抗NF-k B的磷酸化水平及核定位。WB结果同样也显示氯喹能抑制LPS和COM联合刺激导致的NF-k B磷酸化。【结论】氯喹可以通过NF-k B通路抑制草酸钙晶体诱导的NLRP3炎症小体活化,从而减轻乙二醇诱导的继发性高草酸尿症大鼠肾脏炎性损伤及纤维化,并减少草酸钙晶体的沉积。