论文部分内容阅读
目的：高密度脂蛋白(high density lipoprotein, HDL)在促进胆固醇逆向运输、改善脂质沉积、抗炎抗氧化等方面发挥明显的抗动脉粥样硬化的作用。当机体长期处于脂代谢紊乱、炎症或感染的环境中，HDL将转换为失功能HDL(dysfunctional HDL, dys-HDL )，体现出强烈的促炎促氧化功能。甲硫氨酸亚砜还原酶A(methionine sulfoxide reductase A, MsrA)是一种重要的抗氧化酶，对维护机体氧还平衡具有重要意义。前期实验室通过在apoE基因敲除小鼠肝脏高表达MsrA，发现MsrA可以减少肝脏脂质沉积、调节血脂平衡、改善氧化炎症水平，并抑制了小鼠动脉粥样硬化进程。本实验以清道夫受体BI(scavenger receptor class B type I, SR-BI)基因缺陷小鼠作为失功能HDL的模型，构建SR-BI基因缺陷小鼠肝脏MsrA高表达模型，探究肝脏MsrA高表达对失功能HDL的影响。
方法：利用Lipo3000试剂将实验室构建好的重组质粒pWPI-GFP和pWPI-MsrA-GFP与包装质粒pLP1、pLP2和VSVG转染293T细胞，连续收集细胞培养基并用超速离心机浓缩以获得高滴度的慢病毒颗粒，用流式细胞仪检测病毒滴度。将18只雌性SR-BI基因缺陷小鼠随机分为两组并用3%异氟烷麻醉小鼠，分别将Lv-GFP和Lv-MsrA-GFP从球后静脉注射至SR-BI基因缺陷小鼠体内，注射2周后高脂喂养以促进小鼠动脉粥样硬化，13周后将小鼠安乐死，取出组织进行实验分析。慢病毒注射后每2周或4周眼眶取血，用终点法分别检测血清总胆固醇(total cholesterol，TC)、游离胆固醇(free cholesterol，FC)、甘油三酯(triglycerides， TG)水平的含量。快速蛋白质液相色谱(fast protein liquid chromatography，FPLC)检测小鼠血浆脂蛋白分布情况；试剂盒检测血清对氧磷酶1(paraoxonase1，PON1)活性、卵磷脂胆固醇酰基转移酶(lecithin-cholesterol acyltransferase，LCAT)活性；WesternBlotting检测肝脏MsrA高表达水平和小鼠血清中失功能HDL的功能蛋白组分；实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)检测肝脏HDL代谢相关基因和小鼠腹腔巨噬细胞中促炎因子的mRNA表达水平；油红O染色分析小鼠主动脉斑块沉积情况。
结果：将重组质粒和包装质粒共转染293T细胞以获得高滴度的慢病毒颗粒Lv-GFP和Lv-MsrA-GFP。球后静脉注射的方式感染SR-BI基因缺陷小鼠，高脂喂养13周后将小鼠安乐死，检测到小鼠肝脏MsrA蛋白高表达(p<0.01)，SR-BI基因缺陷小鼠肝脏MsrA高表达模型构建成功。与Lv-GFP组相比，Lv-MsrA-GFP组小鼠脾重/体重的比值显著下降(p<0.01)；Lv-MsrA-GFP组小鼠血清TC含量无明显变化，而FC和TG含量明显下降(p<0.01)；FPLC结果显示Lv-MsrA-GFP组小鼠血清中VLDL和LDL含量减少，HDL胆固醇(HDL-cholesterol, HDL-C)增多且HDL向小分子转化；Lv-MsrA-GFP组小鼠血清中HDL功能蛋白组分载脂蛋白A-I(apolipoprotein A-I， apoA-I)(p<0.05)和载脂蛋白E(apolipoprotein E，apoE)(p<0.01)表达水平显著升高，而α1抗胰蛋白酶(alpha 1 antitrypsin， A1AT))(p<0.05)、载脂蛋白A-IV(apolipoprotein A-IV，apoA-IV)(p<0.01)表达均下降；Lv-MsrA-GFP组小鼠血清对PON1活性、LCAT活性均升高(p<0.01)；qRT-PCR检测Lv-MsrA-GFP组小鼠血清孵育的腹腔巨噬细胞，促炎因子白介素(interleukin-6, IL-6)和肿瘤坏死因子(tumornecrosisfactorα,TNFα)mRNA表达水平均下降(p<0.05)，同时检测小鼠肝脏HDL代谢相关基因发现肝脏apoA-I、apoE、PON1、ATP结合盒转运蛋白A1(ATP-binding cassette A1, ABCA1)mRNA表达水平均明显升高(p<0.01)；油红O染色结果显示，Lv-MsrA-GFP组小鼠主动脉斑块沉积现象明显改善(p<0.01)。
结论：我们以SR-BI基因缺陷小鼠作为“dys-HDL”的模型小鼠，用高滴度的慢病毒颗粒Lv-GFP和Lv-MsrA-GFP感染SR-BI基因缺陷小鼠，构建了SR-BI基因缺陷小鼠肝脏MsrA高表达模型。肝脏MsrA高表达有助于调节SR-BI基因缺陷小鼠血浆脂蛋白分布，并通过改善dys-HDL功能蛋白组分修复了dys-HDL的氧化促炎水平，进一步抑制动脉粥样硬化的发展。
方法：利用Lipo3000试剂将实验室构建好的重组质粒pWPI-GFP和pWPI-MsrA-GFP与包装质粒pLP1、pLP2和VSVG转染293T细胞，连续收集细胞培养基并用超速离心机浓缩以获得高滴度的慢病毒颗粒，用流式细胞仪检测病毒滴度。将18只雌性SR-BI基因缺陷小鼠随机分为两组并用3%异氟烷麻醉小鼠，分别将Lv-GFP和Lv-MsrA-GFP从球后静脉注射至SR-BI基因缺陷小鼠体内，注射2周后高脂喂养以促进小鼠动脉粥样硬化，13周后将小鼠安乐死，取出组织进行实验分析。慢病毒注射后每2周或4周眼眶取血，用终点法分别检测血清总胆固醇(total cholesterol，TC)、游离胆固醇(free cholesterol，FC)、甘油三酯(triglycerides， TG)水平的含量。快速蛋白质液相色谱(fast protein liquid chromatography，FPLC)检测小鼠血浆脂蛋白分布情况；试剂盒检测血清对氧磷酶1(paraoxonase1，PON1)活性、卵磷脂胆固醇酰基转移酶(lecithin-cholesterol acyltransferase，LCAT)活性；WesternBlotting检测肝脏MsrA高表达水平和小鼠血清中失功能HDL的功能蛋白组分；实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)检测肝脏HDL代谢相关基因和小鼠腹腔巨噬细胞中促炎因子的mRNA表达水平；油红O染色分析小鼠主动脉斑块沉积情况。
结果：将重组质粒和包装质粒共转染293T细胞以获得高滴度的慢病毒颗粒Lv-GFP和Lv-MsrA-GFP。球后静脉注射的方式感染SR-BI基因缺陷小鼠，高脂喂养13周后将小鼠安乐死，检测到小鼠肝脏MsrA蛋白高表达(p<0.01)，SR-BI基因缺陷小鼠肝脏MsrA高表达模型构建成功。与Lv-GFP组相比，Lv-MsrA-GFP组小鼠脾重/体重的比值显著下降(p<0.01)；Lv-MsrA-GFP组小鼠血清TC含量无明显变化，而FC和TG含量明显下降(p<0.01)；FPLC结果显示Lv-MsrA-GFP组小鼠血清中VLDL和LDL含量减少，HDL胆固醇(HDL-cholesterol, HDL-C)增多且HDL向小分子转化；Lv-MsrA-GFP组小鼠血清中HDL功能蛋白组分载脂蛋白A-I(apolipoprotein A-I， apoA-I)(p<0.05)和载脂蛋白E(apolipoprotein E，apoE)(p<0.01)表达水平显著升高，而α1抗胰蛋白酶(alpha 1 antitrypsin， A1AT))(p<0.05)、载脂蛋白A-IV(apolipoprotein A-IV，apoA-IV)(p<0.01)表达均下降；Lv-MsrA-GFP组小鼠血清对PON1活性、LCAT活性均升高(p<0.01)；qRT-PCR检测Lv-MsrA-GFP组小鼠血清孵育的腹腔巨噬细胞，促炎因子白介素(interleukin-6, IL-6)和肿瘤坏死因子(tumornecrosisfactorα,TNFα)mRNA表达水平均下降(p<0.05)，同时检测小鼠肝脏HDL代谢相关基因发现肝脏apoA-I、apoE、PON1、ATP结合盒转运蛋白A1(ATP-binding cassette A1, ABCA1)mRNA表达水平均明显升高(p<0.01)；油红O染色结果显示，Lv-MsrA-GFP组小鼠主动脉斑块沉积现象明显改善(p<0.01)。
结论：我们以SR-BI基因缺陷小鼠作为“dys-HDL”的模型小鼠，用高滴度的慢病毒颗粒Lv-GFP和Lv-MsrA-GFP感染SR-BI基因缺陷小鼠，构建了SR-BI基因缺陷小鼠肝脏MsrA高表达模型。肝脏MsrA高表达有助于调节SR-BI基因缺陷小鼠血浆脂蛋白分布，并通过改善dys-HDL功能蛋白组分修复了dys-HDL的氧化促炎水平，进一步抑制动脉粥样硬化的发展。