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研究背景浸润到肿瘤组织中的巨噬细胞被称为肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associated macrophages, TAMs),因其在肿瘤微环境中的重要作用而受到广泛关注。最近研究显示,TAMs特别是M2型巨噬细胞参与到多种恶性肿瘤的发生、发展过程中,这其中包括血液学的恶性肿瘤,如霍奇金淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、免疫母T细胞淋巴瘤等,在这些肿瘤中CD163抗体标识阳性的M2型巨噬细胞高表达预示着预后不良。信号传导与转录激活因子3(signal transducers and activators of transcription3, Stat3)是一种与肿瘤的血管生成、免疫抑制、细胞生长、细胞增殖等密切相关的信号因子,在多种恶性肿瘤中,肿瘤细胞Stat3的活化与患者的低生存率密切相关。我们在先前的研究中也已经证明,中枢神经系统淋巴瘤、肾细胞瘤、卵巢癌以及神经胶质瘤细胞与M2型巨噬细胞共培养时,Stat3信号传导通路会明显活化,但是细胞间相互作用的分子机制并没有得到详细阐述。BrdU是一种DNA前体胸腺嘧啶核苷类似物,能够竞争性掺入DNA合成期细胞单链DNA核苷酸序列替代胸腺嘧啶。由于组织细胞内无内源性BrdU存在,故可通过测定细胞中BrdU掺入水平来间接反映细胞增殖的状况。目的：探讨在体外共培养试验中,Stat3活化对B细胞淋巴瘤细胞与巨噬细胞间相互作用的意义。方法：1.体外共培养对淋巴瘤细胞增殖的影响外周血由来的单核细胞来自于2名健康志愿者,免疫磁珠法收集CD14阳性单核细胞。GM-CSF加入单核细胞培养基中刺激5天诱导其分化成未成熟的巨噬细胞,再加入IFN-y刺激24h诱导未成熟的巨噬细胞分化成成熟的M1型巨噬细胞；GM-CSF和M-CSF共同加入单核细胞培养基中刺激5天诱导其分化成未成熟的M2型巨噬细胞,再加入IL-10刺激24h诱导未成熟的M2型巨噬细胞分化成成熟的M2型巨噬细胞。淋巴瘤细胞系与巨噬细胞在含有2%FBS/D-MEM的24孔培养皿中直接共培养,间接共培养是用一个多聚碳酸膜将巨噬细胞与淋巴瘤细胞分开,共培养3天后,BrdU掺入并行双重免疫染色评价肿瘤细胞的增殖状况。简略说明双重免疫染色的过程：加入BrdU孵育3h后,细胞涂片离心机将细胞收集到载玻片上并用丙酮固定,CD204作为全部巨噬细胞的标识物进行免疫染色并行DAB显色,甘氨酸缓冲液(PH2.2)冲洗残余抗体,抗BrdU抗体染色并用HistiGreen溶液显色。2. Stat3活化对淋巴瘤细胞增殖的影响siRNA干扰沉默淋巴瘤细胞Stat3, Western blot检测SLVL细胞中Stat3蛋白的表达水平。共培养3天后,BrdU掺入并行双重免疫染色评价肿瘤细胞的增殖状况。3.C5a对淋巴瘤细胞与巨噬细胞间相互作用的影响应用细胞因子分析分别检测单培养和共培养时培养液中存在的的可溶性细胞因子,RT-PCR检测C5a受体的表达。SLVL细胞在C5a刺激下培养24h,然后BrdU掺入并行免疫染色评价其对肿瘤细胞增殖的影响,行Western blot检测SLVL细胞中pStat3蛋白的表达水平。SLVL细胞与M2型巨噬细胞共培养的培养液中加入C5a受体阻断剂,共同孵育24h,BrdU掺入并行免疫染色评价肿瘤细胞的增殖状况。结果：1.与M2型巨噬细胞共培养后,淋巴瘤细胞增殖活性显著增强B细胞淋巴瘤系SLVL细胞分别与imM(未成熟的)、M1及M2型巨噬细胞共培养三天,BrdU掺入后行双重免疫染色评价淋巴瘤细胞的细胞增殖情况,镜下观察发现,与M2型巨噬细胞直接共培养的SLVL细胞中,更多掺入了BrdU。测量SLVL细胞核的最大直径发现,单培养的SLVL细胞为15.7±2.8μm,与M2型巨噬细胞共培养的SLVL细胞为18.8零2.7μm (P=0.003, n=20)。相比单培养以及imM、M1型巨噬细胞共培养,与M2型巨噬细胞共培养的的SLVL细胞中更多的掺入了BrdU;在另外两种B细胞淋巴瘤细胞(Raji, Daudi)的共培养实验中,也得到了相似的结果。另外,我们尝试用一个跨膜培养系统将巨噬细胞与SLVL细胞分开进行间接共培养,相比之下,直接共培养的SLVL细胞中BrdU掺入更加明显。2.巨噬细胞诱导淋巴瘤细胞增殖依赖于Stat3的活化为了检测Stat3活化在淋巴瘤细胞与巨噬细胞间相互作用中的意义,共培养实验前用siRNA沉默SLVL细胞Stat3基因,结果显示,Stat3蛋白的下调明显抑制了SLVL细胞中BrdU的掺入。3.C5a参与了M2型巨噬细胞与淋巴瘤细胞间的相互作用对M1、M2、SLVL以及共培养的培养液进行细胞因子分析,结果在M2的上清中发现了大量C5a。巧合的是SLVL细胞表达C5a的受体,在SLVL细胞中加入C5a进行培养,行Western blot测定其pStat3的表达,结果显示pStat3蛋白表达明显增强；经C5a刺激后更多的SLVL细胞中掺入了BrdU;而已经用siRNA沉默Stat3基因的SLVL细胞经C5a刺激后,其BrdU掺入并无明显变化。最后,在SLVL与M2型巨噬细胞细胞的共培养液中加入C5a受体拮抗剂,发现掺入BrdU的SLVL细胞数略微减少,但是这种变化并不十分明显。结论：1.B细胞淋巴瘤细胞与M2型巨噬细胞相互作用导致Stat3活化是肿瘤进展过程中非常重要的步骤,能够使M2型巨噬细胞失活的Stat3抑制剂或者化合物可能会成为一种对B细胞淋巴瘤患者治疗有效的辅助药物。2.巨噬细胞由来的C5a诱导Stat3活化可能只是细胞间相互作用中的一个机制,阻断C5a作为一种治疗B细胞淋巴瘤的新颖方法需要更深入的研究。