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肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是全球第六大最常见的癌症，是当今世界范围内恶性程度、发病率、死亡率均较高的恶性肿瘤之一，目前肝癌治疗手段有限，肝脏移植、手术切除、经动脉化学栓塞及射频消融是治疗早期HCC的有效策略。不幸的是，肝癌通常被诊断为晚期，晚期进展期肝癌的治疗选择有限。内科治疗是系统治疗的重要手段，但当前严重的耐药机制阻碍了化疗作用的发挥。
内质网应激（ERS，endoplasmic reticulum stress）是指是指内质网在缺血、缺氧、损伤、氧化应激、糖激化及DNA损伤等多种物理化学因素下引起的内质网生理功能紊乱，包括钙离子代谢失衡、卵磷脂合成障碍、细胞内蛋白质合成过快甚至超过蛋白质合成能力的一种亚细胞器病理状态，是细胞的一种自我保护机制。中国的肝细胞癌通常由病毒性肝炎发展而来，国外通常由酒精性肝病发展而来，细胞在病毒感染、营养条件和血液供应不足及炎症等不断刺激下等均可导致实体瘤内存在低糖和缺氧等应激环境，从而诱发肝癌细胞产生内质网应激。
巨噬细胞（Macrophages）是肿瘤微环境中最多的免疫细胞，能吞噬并处理大型异物、细胞排泄的产物及衰老的细胞和细胞器等，广泛参与调节肿瘤微环境的免疫塑造，本课题组前期研究证实肿瘤细胞可将ERS信号传递到肿瘤微环境中，巨噬细胞吞噬摄取后可增强其ERS相关蛋白的表达,也产生ERS。
自噬（Autophagy）是真核细胞一种溶酶体降解途径，是一种基础的生理现象，主要表现为需要降解的蛋白质和受损的细胞器通过内膜包裹形成自噬小体而后与溶酶体融合降解其内容物的过程，从而实现细胞器的更新及营养素的回收利用，并在维持稳态中发挥重要作用，有研究发现，自噬与肿瘤的耐药密切相关。
索拉非尼（Sorafenib）是目前少有的一线进展期肝癌的多靶点靶向治疗药物，其药效作用机制为多靶点赖氨酸激酶抑制肿瘤细胞增殖及抗血管生成共同作用的结果，然而在一些三期的临床实验中，只有约2%-3%肝癌患者有部分疗效，大多数患者均表现出药物治疗抵抗。有研究结果发现，索拉非尼可诱导hepG2和BEL-7402肝癌细胞发生自噬，使用自噬抑制剂氯喹可增加肝癌细胞对索拉非尼敏感性。可调节自噬活性，对细胞起到保护作用。
外泌体（Exosomes）是一种分泌细胞外的小分子囊泡，其直径大约为40-100nm之间。外泌体广泛参与细胞间的沟通，与肿瘤的发生、侵袭，转移，治疗等过程密切相关。有研究报道外泌体能将肿瘤细胞的ERS信号传递给周围的巨噬细胞，巨噬细胞接受ERS信号后同样可分泌外泌体影响肝癌细胞自噬，并引发凋亡抵抗，而索拉菲尼对肝癌细胞治疗抵抗的机制尚不清楚，是否与ERS环境下的巨噬细胞外泌体有关？从而引发肝癌细胞自噬增强导致凋亡抵抗？本课题拟探讨巨噬细胞内质网应激相关外泌体对索拉菲尼抗肿瘤作用的影响并通过研究自噬水平探讨其作用机制，为肝癌的临床治疗提供新思路。
目的:
（1）探讨巨噬细胞内质网应激相关外泌体对索拉菲尼抗肿瘤作用的影响。
（2）探讨ERS巨噬细胞外泌体诱导肝癌细胞对索拉菲尼凋亡抵抗机制是否与肝癌细胞自噬水平变化有关。
方法:
(1)将处于对数生长期的肝癌细胞株hepG2与huh7分别与提前稀释的五个浓度的索拉非尼（1.25、2.5、5、10、20μmol/l）共同培养24，48，72h，使用CCK-8法检测索拉菲尼对肝癌细胞的抑制率，并同时计算索拉非尼的IC50值。选取药效作用明显且同时接近索拉菲尼在临床治疗中人体血液稳态峰浓度进行后续实验；
(2)使用PMA诱导人单核细胞THP-1向巨噬细胞转化，收集培养基上清并使用ExoQuick-TC试剂盒提取普通巨噬细胞外泌体（con-exo），再使用ERS诱导剂衣霉素（tunicamycin，TM）诱导人单核巨噬细胞发生ERS，收集培养基上清并使用ExoQuick-TC试剂盒分离ERS巨噬细胞外泌体（ERS-exo），电子显微镜观察其形态，并使用蛋白印迹法检测CD63标志蛋白和的排除蛋白Calnexin表达；
(3)细胞实验分为对照组和实验组，实验组分TM组，索拉非尼组，TM＋索拉非尼＋con-exo组、TM＋索拉非尼＋ERS-exo组，分别与ERS后的肝癌细胞株HepG2和huh7共培养，利用流式细胞术和TUNEL法检测肝癌细胞凋亡。
(4)将con-exo＋索拉非尼、ERS-exo＋索拉非尼分别与ERS前后的肝癌细胞株HepG2和huh7共培养，Western Blotting法检测肝癌细胞中LC3、P62、Beclin1等自噬相关蛋白的表达。
结果:
(1)CCK-8结果显示：索拉非尼对肝癌细胞株hepG2和huh7均具有抑制作用且表现为时间和剂量的抗肿瘤效应，并且在两个细胞株上的48h的IC50值分别为15.2μm和13.5μm，72h的IC50值分别为10.3μm和9.2μm。
(2)在电子显微镜下可观察到有“蝶形”形态的双层膜性囊泡，其直径大约在40-100nm之间，符合外泌体的典型特征；采用Western Blotting法检测到CD63外泌体标志蛋白的表达，而排除蛋白Calnexin表达为阴性；
(3)流式细胞术和TUNEL染色结果显示无论是hepG2还是huh7细胞株，索拉非尼组肝癌细胞凋亡明显，TM组与对照组相比肝癌细胞凋亡略有所增加，与con-exo共培养的肝癌细胞凋亡率相比索拉菲尼组显著增加，而与ERS-exo共培养其凋亡率相比索拉菲尼组明显降低。实验均重复进行三次，对照组凋亡率大约在5%左右，TM组在10%-15%左右，索拉菲尼组在30%-35%左右，加入con-exo组在45%-50%左右，而加入ERS-exo大约在15%-20%左右。
(4)Western Blotting检测到与对照组相比，TM组和索拉菲尼组均表现出自噬增强，LC3II/LC3I比例和Beclinl表达轻度增加，P62轻度降低。而TM+ERS-exo＋索拉非尼组中LC3II/LC3I比例显著增高，P62表达明显降低，Beclin1表达明显增加，而TM+con-exo＋索拉非尼组中各种蛋白的表达与TM组及索拉菲尼组相比略有所降低。
结论:
（1）普通巨噬细胞外泌体（con-exo）可增强索拉菲尼介导的肝癌细胞凋亡，而内质网应激巨噬细胞外泌体（ERS-exo）诱导肝癌细胞对索拉菲尼产生凋亡抵抗。
（2）内质网应激巨噬细胞外泌体（ERS-exo）诱导肝癌细胞对索拉菲尼产生凋亡抵抗的机制可能与自噬水平的增强有关。
内质网应激（ERS，endoplasmic reticulum stress）是指是指内质网在缺血、缺氧、损伤、氧化应激、糖激化及DNA损伤等多种物理化学因素下引起的内质网生理功能紊乱，包括钙离子代谢失衡、卵磷脂合成障碍、细胞内蛋白质合成过快甚至超过蛋白质合成能力的一种亚细胞器病理状态，是细胞的一种自我保护机制。中国的肝细胞癌通常由病毒性肝炎发展而来，国外通常由酒精性肝病发展而来，细胞在病毒感染、营养条件和血液供应不足及炎症等不断刺激下等均可导致实体瘤内存在低糖和缺氧等应激环境，从而诱发肝癌细胞产生内质网应激。
巨噬细胞（Macrophages）是肿瘤微环境中最多的免疫细胞，能吞噬并处理大型异物、细胞排泄的产物及衰老的细胞和细胞器等，广泛参与调节肿瘤微环境的免疫塑造，本课题组前期研究证实肿瘤细胞可将ERS信号传递到肿瘤微环境中，巨噬细胞吞噬摄取后可增强其ERS相关蛋白的表达,也产生ERS。
自噬（Autophagy）是真核细胞一种溶酶体降解途径，是一种基础的生理现象，主要表现为需要降解的蛋白质和受损的细胞器通过内膜包裹形成自噬小体而后与溶酶体融合降解其内容物的过程，从而实现细胞器的更新及营养素的回收利用，并在维持稳态中发挥重要作用，有研究发现，自噬与肿瘤的耐药密切相关。
索拉非尼（Sorafenib）是目前少有的一线进展期肝癌的多靶点靶向治疗药物，其药效作用机制为多靶点赖氨酸激酶抑制肿瘤细胞增殖及抗血管生成共同作用的结果，然而在一些三期的临床实验中，只有约2%-3%肝癌患者有部分疗效，大多数患者均表现出药物治疗抵抗。有研究结果发现，索拉非尼可诱导hepG2和BEL-7402肝癌细胞发生自噬，使用自噬抑制剂氯喹可增加肝癌细胞对索拉非尼敏感性。可调节自噬活性，对细胞起到保护作用。
外泌体（Exosomes）是一种分泌细胞外的小分子囊泡，其直径大约为40-100nm之间。外泌体广泛参与细胞间的沟通，与肿瘤的发生、侵袭，转移，治疗等过程密切相关。有研究报道外泌体能将肿瘤细胞的ERS信号传递给周围的巨噬细胞，巨噬细胞接受ERS信号后同样可分泌外泌体影响肝癌细胞自噬，并引发凋亡抵抗，而索拉菲尼对肝癌细胞治疗抵抗的机制尚不清楚，是否与ERS环境下的巨噬细胞外泌体有关？从而引发肝癌细胞自噬增强导致凋亡抵抗？本课题拟探讨巨噬细胞内质网应激相关外泌体对索拉菲尼抗肿瘤作用的影响并通过研究自噬水平探讨其作用机制，为肝癌的临床治疗提供新思路。
目的:
（1）探讨巨噬细胞内质网应激相关外泌体对索拉菲尼抗肿瘤作用的影响。
（2）探讨ERS巨噬细胞外泌体诱导肝癌细胞对索拉菲尼凋亡抵抗机制是否与肝癌细胞自噬水平变化有关。
方法:
(1)将处于对数生长期的肝癌细胞株hepG2与huh7分别与提前稀释的五个浓度的索拉非尼（1.25、2.5、5、10、20μmol/l）共同培养24，48，72h，使用CCK-8法检测索拉菲尼对肝癌细胞的抑制率，并同时计算索拉非尼的IC50值。选取药效作用明显且同时接近索拉菲尼在临床治疗中人体血液稳态峰浓度进行后续实验；
(2)使用PMA诱导人单核细胞THP-1向巨噬细胞转化，收集培养基上清并使用ExoQuick-TC试剂盒提取普通巨噬细胞外泌体（con-exo），再使用ERS诱导剂衣霉素（tunicamycin，TM）诱导人单核巨噬细胞发生ERS，收集培养基上清并使用ExoQuick-TC试剂盒分离ERS巨噬细胞外泌体（ERS-exo），电子显微镜观察其形态，并使用蛋白印迹法检测CD63标志蛋白和的排除蛋白Calnexin表达；
(3)细胞实验分为对照组和实验组，实验组分TM组，索拉非尼组，TM＋索拉非尼＋con-exo组、TM＋索拉非尼＋ERS-exo组，分别与ERS后的肝癌细胞株HepG2和huh7共培养，利用流式细胞术和TUNEL法检测肝癌细胞凋亡。
(4)将con-exo＋索拉非尼、ERS-exo＋索拉非尼分别与ERS前后的肝癌细胞株HepG2和huh7共培养，Western Blotting法检测肝癌细胞中LC3、P62、Beclin1等自噬相关蛋白的表达。
结果:
(1)CCK-8结果显示：索拉非尼对肝癌细胞株hepG2和huh7均具有抑制作用且表现为时间和剂量的抗肿瘤效应，并且在两个细胞株上的48h的IC50值分别为15.2μm和13.5μm，72h的IC50值分别为10.3μm和9.2μm。
(2)在电子显微镜下可观察到有“蝶形”形态的双层膜性囊泡，其直径大约在40-100nm之间，符合外泌体的典型特征；采用Western Blotting法检测到CD63外泌体标志蛋白的表达，而排除蛋白Calnexin表达为阴性；
(3)流式细胞术和TUNEL染色结果显示无论是hepG2还是huh7细胞株，索拉非尼组肝癌细胞凋亡明显，TM组与对照组相比肝癌细胞凋亡略有所增加，与con-exo共培养的肝癌细胞凋亡率相比索拉菲尼组显著增加，而与ERS-exo共培养其凋亡率相比索拉菲尼组明显降低。实验均重复进行三次，对照组凋亡率大约在5%左右，TM组在10%-15%左右，索拉菲尼组在30%-35%左右，加入con-exo组在45%-50%左右，而加入ERS-exo大约在15%-20%左右。
(4)Western Blotting检测到与对照组相比，TM组和索拉菲尼组均表现出自噬增强，LC3II/LC3I比例和Beclinl表达轻度增加，P62轻度降低。而TM+ERS-exo＋索拉非尼组中LC3II/LC3I比例显著增高，P62表达明显降低，Beclin1表达明显增加，而TM+con-exo＋索拉非尼组中各种蛋白的表达与TM组及索拉菲尼组相比略有所降低。
结论:
（1）普通巨噬细胞外泌体（con-exo）可增强索拉菲尼介导的肝癌细胞凋亡，而内质网应激巨噬细胞外泌体（ERS-exo）诱导肝癌细胞对索拉菲尼产生凋亡抵抗。
（2）内质网应激巨噬细胞外泌体（ERS-exo）诱导肝癌细胞对索拉菲尼产生凋亡抵抗的机制可能与自噬水平的增强有关。