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目的明确TSA是否对MSCs向心肌细胞分化有促进作用;探讨MSCs向心肌细胞分化过程中乙酰化特异性调控的作用机制。材料与方法1.细胞培养:取Wistar大鼠的股骨和胫骨骨髓,用贴壁法分离、培养、扩增体外MSCs;取Wistar大鼠新生鼠(1～3天)的心脏,用消化分离法、差速贴壁法及化学试剂抑制法分离、纯化、培养心肌细胞。2.诱导实验:本实验分为两组即原始对照组(MSCs)、诱导组(包括与心肌细胞共培养和5-aza诱导两种方式)。检测指标:(1)采用基于SYBR.GREENI法的实时荧光定量PCR检测心肌细胞早期转录因子GATA-4、NKx2.5、MEF2c;(2)免疫荧光观察心肌特异性蛋白MHC、CX43、cTnT表达变化;(3)Western-blot分析心肌特异性肌钙蛋白T(cardiac muscle Troponin T cTnT)表达量。3.诱导后干预实验:( 1)5-氮胞苷诱导M SCs细胞;( 2)用transwell插入式培养皿构建MSCs和心肌细胞共培养模式。两组细胞分别用不同浓度的去乙酰化酶抑制剂TSA进行干预。检测指标同上。4.机制探讨实验:应用染色质免疫共沉淀技术(ChIP)沉淀出与Gcn5蛋白结合的心肌细胞相关基因,设计针对心肌细胞特异基因GATA-4、NKx2.5、MEF2c的DNA引物,实时荧光定量PCR检测几种基因的表达。结果1. MSCs及心肌细胞培养状况S Cs接种24小时后开始贴壁生长,可见稀少的呈长梭形的贴壁细胞3～4天后开始集落样增殖,梭形贴壁细胞开始增多,集落周围的贴壁细胞逐渐开始融合;传代后细胞呈束状、漩涡状排列,随着换液与传代, MSCs逐渐得到纯化。分离的心肌细胞贴壁生长第3天细胞相互接触交织,逐渐形成细胞簇或细胞单层,镜下不同视野下可见搏动的细胞团(含单个自发搏动的细胞),搏动呈同步性,搏动频率在40～60次/ min。l周后大量细胞成团收缩,同时成纤维细胞开始生长。2.共培养诱导组: MSCs与心肌细胞共培养1周,实时荧光定量PCR检测心肌细胞早期转录因子,结果显示心肌细胞早期转录因子GATA-4、NKx2.5和MEF2c出现表达;免疫荧光显色心肌细胞特异蛋白,在MSCs胞浆可见心肌特异蛋白cTnT及CX43和MHC表达; Western-blot检测出现c TnT的表达。5-aza诱导组: MSCs经5-aza诱导实时荧光定量PCR显示心肌细胞早期转录因子GATA-4、NKx2.5和MEF2c出现表达; Western-blot检测MSCs也出现cTnT的表达。3.诱导后干预实验:共培养和经不同浓度TSA干预:实时荧光定量PCR检测心肌细胞早期转录因子,TSA500nmol/L浓度与其余两组不同浓度TSA比较表达最高,差异有显著性(P<0.05);而因子GATA-4和MEF2c在100nmol/L与300nmol/L组间比较没有显著差异性。NKx2.5的表达在一定浓度范围随TSA浓度增加呈上调趋势差异有显著性(P<0.05);免疫荧光检测MSCs向心肌样细胞分化率,胞浆可见心肌特异性蛋白cTnT和CX43出现表达,随培养时间延长和TSA干预浓度提高,MSCs的分化率逐步提高,但提高幅度较低。Western-blot检测cTnT的表达量,共培养及干预组都比MSCs组有提高,共培养组与干预组间比较,100nmol/L、300nmol/L、500nmol/L都比共培养组有提高;TSA干预组间比较,500nmol/L浓度与其余两组不同浓度TSA比较表达最高,差异有显著性(P<0.05);100nmol/L与300nmol/L之间比较没有显著差异性。5-aza诱导和不同浓度TSA干预:心肌早期转录因子表达水平和心肌特异性蛋白cTnT组间比较,差异有显著性(P<0.05),在一定浓度范围表达随TSA浓度增加呈正相关。Western-blot检测cTnT的表达量,经三种不同浓度(100nmol/L、300nmo/L、500nmol/L)TSA干预后与5-aza诱导组比较,在一定浓度范围内蛋白表达量上调,各组间比较TSA100 nmol/L与300 nmol/L;TSA100 nmol/L与TSA500 nmol/L;TSA300 nmol/L与TSA500 nmol/L组间比较差异有显著性(P<0.05)。4.利用ChIP技术沉淀出与Gcn5蛋白一起结合的核酸-蛋白复合物,实时荧光定量PCR检测到该核酸中有心肌早期发育特异基因GATA-4、NKx2.5的DNA启动子表达。结论1.HDAC酶抑制剂TSA对MSCs向心肌样细胞分化有促进作用,在一定浓度范围内,细胞分化与TSA浓度呈正相关。2.Gcn5乙酰化复合体调控MSCs向心肌细胞分化的作用机制之一,是启动了心肌细胞早期发育特异性基因的表达。