目的：在全球致盲疾病中，白内障位居第一。近年来，随着糖尿病发病率的迅猛增长，糖尿病性白内障(diabetic cataract，DC)已成为糖尿病患者失明的主要原因。在我国，年龄标准化后的总糖尿病患病率和前驱糖尿病患病率分别达9.7％和15.5％，其中有9240万成年糖尿病患者和1.5亿成年前驱糖尿病患者。2型糖尿病患者的白内障发病率竟达60％以上。因此，DC的发病机制及防治已成为当前研究的焦点。　　 研究证实，氧化应激是糖尿病慢性并发症发生的主要机制，导致氧化应激的关键酶是诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)，iNOS一旦被诱导，即可合成大量NO，活性持续可达20h。NO极易与超氧阴离子反应生成过氧亚硝基阴离子(peroxynitrite，ONOO-)，而ONOO-及其衍生物是目前已知氧化能力最强的一类物质，其氧化能力是H2O2的2000多倍，可引起剧烈的氧化应激反应，引发或加速DC的发生。　　 已知氧化应激关键酶iNOS的主要调控因子是核转录因子-κB(nuclearfactor-kappa B，NF-κB)，而且其基因启动子中含有NF-κB的结合位点。常态下，NF-κB滞留于细胞质中，以最常见的P65/P50二聚体形式存在，处于失活状态。当细胞受到高糖等因素刺激时，NF-κB被激活，移位至细胞核内，与NF-κB调控位点结合，发挥其调控基因转录的功能。　　 我们的前期研究发现，离体培养的人晶状体上皮细胞株SRA01/04受高糖刺激后，NF-κB P65的表达量明显增加，并迅速移位至细胞核内。那么，进入细胞核后的NF-κB P65是否会与iNOS基因启动子结合，高糖能否增强它们的结合能力，又能否激活iNOS基因的转录和表达，有待研究证实。　　 丹酚酸B(Salvianolic acid B，SalB)为中药丹参中重要的水溶性药效成分，在结构上含有多个游离酚羟基，具有极强的抗氧化和清除自由基能力，其抗氧化能力约为维生素E的1000倍，是目前已知的抗氧化作用最强的天然产物之一，能够抑制晶状体脂质过氧化反应。那么，丹酚酸B对于DC的防治作用是什么，机制如何，是否与iNOS基因的转录有关?　　 本实验采用含高糖的DMEM培养基，孵育正常培养的SRA01/04细胞，观察iNOS的表达变化，利用染色体免疫共沉淀(ChromatinImmunoprecipitation，ChIP)技术研究NF-κB P65与iNOS启动子的结合能力。同时，本实验还观察了SalB对iNOS表达的影响，为临床防治DC提供基础实验依据。　　 方法：　　 1.细胞培养与分组　　 选用人晶状体上皮细胞株SRA01/04作为试验用细胞，采用低糖DMEM培养基培养。当细胞生长满度达培养瓶底面积的80％时，进行传代。　　 为研究葡萄糖对iNOS表达的影响，对细胞进行随机分组，按葡萄糖浓度的不同，分为4组：5.5mmol/L葡萄糖组(正常对照组)、15mmol/L葡萄糖组、25mmol/L葡萄糖组、30mmol/L葡萄糖组，分别孵育细胞8h；按葡萄糖刺激细胞时间的不同，分为5组：0h组、1h组、2h组、4h组、8h组。　　 为观察SalB对iNOS表达的作用，将细胞随机分为4组：5.5mmol/L葡萄糖组(正常对照组)、25mmol/L葡萄糖组、25mmol/L葡萄糖+30mmol/LSalB组、25mmol/L甘露醇组，分别孵育细胞8h。　　 为探讨高糖对iNOS表达影响的机制，用5.5mmol/L葡萄糖组和25mmol/L葡萄糖组细胞进行试验。　　 2.晶状体上皮细胞iNOS转录水平的变化　　 2.1总RNA的提取：Trizol试剂盒法。　　 2.2 mRNA的测定：用β-actin做内参，利用RT-PCR法测定iNOS mRNA。　　 3.晶状体上皮细胞iNOS蛋白表达的变化　　 3.1细胞总蛋白的提取：细胞裂解液法。　　 3.2蛋白定量：Lowry法。　　 3.3晶状体上皮细胞iNOS蛋白的检测：Western-blotting法。　　 4.高糖对SRA01/04细胞iNOS表达影响的机制：ChIP技术。　　 结果：　　 1.不同浓度葡萄糖对iNOS表达的影响　　 高糖组iNOS mRNA的表达均升高，与正常对照组相比，差异有统计学意义(P<0.05)；25mmol/L葡萄糖组和30mmol/L葡萄糖组iNOS mRNA的表达高于15mmol/L葡萄糖组，差异有统计学意义(P<0.05)；30mmol/L葡萄糖组高于25mmol/L葡萄糖组，但差异无统计学意义(P>0.05)。(见附图2-1、附图2-2和附表1)　　 Western-blotting检测结果显示，正常对照组iNOS含量最少，各高糖组iNOS含量均高于正常对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；30mmol/L葡萄糖组iNOS含量最高，与15mmol/L葡萄糖组的差异有统计学意义(P<0.05)，与25mmol/L葡萄糖组的差异无统计学意义(P>0.05)。(见附图2-3、附图2-4和附表1)　　 2.高糖(25mmol/L)作用不同时间对iNOS表达的影响　　 iNOS mRNA的表达量呈时间依赖性，4h组明显增加，显著高于0h组、1h组和2h组，差异有统计学意义(P<0.05)；8h组最高，与其它各组之间的差异均有统计学意义(P<0.05)。Western-blotting结果同RT-PCR结果。(见附图3-1、附图3-2、附图3-3、附图3-4和附表2)　　 3.SalB对iNOS表达的影响　　 与正常对照组相比，甘露醇组iNOS mRNA有增高趋势，但差异无统计学意义(P>0.05)。25mmol/L葡萄糖组iNOS mRNA明显高于正常对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。SalB组iNOS mRNA的表达高于正常对照组，差异无统计学意义(P>0.05)。与25mmol/L葡萄糖组相比，SalB组iNOSmRNA的表达偏低，差异有统计学意义(P<0.05)。Western-blotting检测结果与RT-PCR结果相一致。(见附图4-1、附图4-2、附图4-3、附图4-4和附表3)　　 4.高糖对SRA01/04细胞iNOS表达影响的机制　　 用含5.5mmol/L葡萄糖培养基孵育的细胞，ChIP结果显示：Input组和阳性抗体对照组有扩增产物条带出现，其余各组无条带出现。用含25mmol/L葡萄糖培养基孵育的细胞，ChIP结果显示：Input组、实验组和阳性抗体对照组都有扩增产物条带出现，而阴性对照组和阴性抗体对照组无条带出现。Input组条带的光密度值明显大于实验组和阳性抗体对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；实验组和阳性抗体对照组条带的光密度值差异不明显，无统计学意义(P>0.05)。(见附图5-1、附图5-2、附图5-3和附表4)　　 结论：　　 1.高糖可使人晶状体上皮细胞株(SRA01/04)iNOS表达增加，并呈明显的浓度和时间依赖性。　　 2.高糖(25mmol/L)能增强SRA01/04细胞NF-κB P65与iNOS启动子的结合，激活iNOS基因表达。　　 3.丹酚酸B可降低高糖(25mmol/L)诱导的SRA01/04细胞iNOS表达。