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目的CD40-CD40L是一种非常重要的受体蛋白酪氨酸激酶,在细胞信号转导中发挥着重要作用。既往研究表明Graves眼病(Graves’ophthalmopathy,GO)患者眼眶组织中CD40-CD40L的高表达参与了GO的病理过程,ICAM-1在眼眶结缔组织中表达异常。然而,CD40-CD40L是否参与调节眼眶成纤维细胞(orbital fibroblasts,OF)合成ICAM-1未有明确研究。本课题拟通过对CD40L诱导体外培养的人眼眶成纤维细胞致炎过程中ICAM-1与丝裂酶原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase,MAPK)、Src家族激酶(Syk、Lyn)、核因子-κB(nuclear factor-kappa B,NF-κB)信号转导通路关键酶的表达规律及其相互关系的研究,探讨GO病理过程中ICAM-1的表达变化及意义;探索GO炎症过程中CD40-CD40L共刺激通路参与调节ICAM-1的上游信号转导途径及各通路在此过程中的相互关系。实验方法及对象1.应用免疫组化S-P法和双酶法检测CD40-CD40L、ICAM-1-LFA-1蛋白在GO患者眼眶组织中的表达;原代培养GO患者及正常人的眼眶成纤维细胞并用免疫组化技术检测其表面的CD40和ICAM-1。2.应用RT-PCR方法检测CD40L诱导OF合成ICAM-1的mRNA水平;应用酶联免疫吸附测定技术(ELISA)检测CD40L诱导OF合成ICAM-1的蛋白水平。3.预先添加各种信号通路抑制剂(PD98059,SB203580,SP600125,PDTC,PP1)后,应用实时荧光定量PCR检测CD40L诱导OF合成ICAM-1的mRNA水平;应用Western-blot方法检测CD40L刺激OF引起MAPKs家族(p38、ERK1/2、JNK)的磷酸化改变;应用EMSA方法检测CD40L刺激OF引起NF-κB的活性改变。4.应用Western-blot方法检测CD40L刺激OF引起Src家族(Syk、Lyn)的磷酸化改变;预先调加Syk激酶抑制剂(Piceatannol)后,应用实时荧光定量PCR检测CD40L诱导OF合成ICAM-1的mRNA水平;应用Western-blot、EMSA方法检测Syk激酶与MAPKs、NF-κB信号通路之间的关系。5.构建pEGFP-C2-TSHR质粒,肌肉注射免疫6周龄雌性BALB/c小鼠(实验组15只、对照组10只),第3和6周加强免疫两次。第18周时分别处死两组小鼠,分离其甲状腺和眼眶组织行普通光学显微镜检查;摘眼球取血,以放射免疫法测定小鼠血清TT4水平,ELISA法检测血清TRAb。结果1.免疫组化结果显示:GO组的眼眶结缔组织中可见高表达CD40、ICAM-1蛋白的成纤维细胞以及高表达ICAM-1的血管内皮细胞,可见散在分布的CD4+、CD8+淋巴细胞,大量淋巴细胞高表达LFA-1;双酶标组化显示CD40阳性表达的成纤维周围浸润CD40L阳性表达的淋巴细胞;ICAM-1强阳性的眼眶成纤维细胞与LFA-1强阳性淋巴细胞以直接接触的形式存在;在ICAM-1阳性的血管内皮细胞旁聚集大量LFA-1阳性的淋巴细胞。成功培养原代眼眶成纤维细胞。2. RT-PCR及ELISA结果显示GO组的眼眶成纤维细胞在静息状态时,ICAM-1的mRNA水平和蛋白水平都高于正常组(P<0.05);两组的OF经CD40L诱导后ICAM-1的mRNA水平和蛋白水平都高于静息状态(P<0.05);ICAM-1的mRNA表达量与CD40L的刺激呈剂量依赖关系,在CD40L浓度为50ng/ml时,细胞内ICAM-1的mRNA水平显著性地升高(P<0.01),在CD40L激活后2小时,mRNA水平达到最高值(P<0.01)。3.荧光定量PCR结果显示:MAPKs抑制剂(SP600125,PD98059,SB203580)、Src家族激酶抑制剂(PP1)、NF-κB抑制剂(PDTC)明显减少眼眶成纤维细胞经CD40L激活后ICAM-1的mRNA表达量(P<0.01)。Western-blot结果显示CD40L激活眼眶成纤维细胞后, MAPK(ERK1/2、JNK、p38)三种蛋白都发生了不同程度的磷酸化改变,并且这种磷酸化水平随时间的改变而改变;眼眶成纤维细胞激活后,IκB的磷酸化水平增高、NF-κB的活性增强。ERK1/2、JNK信号通路抑制剂(SP600125,PD98059)可以显著性减少IκB的磷酸化水平和NF-κB的活性(P<0.05),而p38信号通路抑制剂(SB203580)对IκB的磷酸化水平和NF-κB的活性无明显影响(P>0.05)。4.Western-blot结果显示CD40L激活眼眶成纤维细胞后,Src家族的两种激酶(Syk、Lyn)都发生了不同程度的磷酸化改变,Lyn的磷酸化时相要早于Syk。荧光定量PCR结果显示:Syk激酶抑制剂(Piceatannol,10μM)明显减少ICAM-1的mRNA相对表达量(P<0.05)。EMSA及Western-blot结果显示Syk激酶抑制剂(Piceatannol,10、25μM)显著性降低NF-κB的活性和IκB的磷酸化水平(P<0.05),Syk激酶抑制剂(Piceatannol)显著性降低MAPKs(ERK1/2、JNK、p38)三种蛋白的磷酸化水平(P<0.05)。5.实验组15只小鼠中的10只小鼠(66.7%)出现甲状腺和眼眶病理改变。甲状腺肿大、充血,光镜下见明显的小滤泡增生,滤泡上皮细胞增多、变大呈高立方形,偶见小乳头形成突出滤泡腔内;腔内胶质含量少,部分可见吸收空泡;滤泡间组织水肿、充血,散在炎症细胞浸润;眼眶局部纤维组织和脂肪组织增生,肌纤维粗细不均,横纹模糊,肌浆凝聚,部分肌纤维透明变性断裂。实验组小鼠血清TT4(64.58±7.61μg/L)和TRAb(11.00±9.91)水平显著性高于对照组小鼠血清TT4(56.42±4.19μg/L)和TRAb(2.40±3.24)(P<0.05),其中8只小鼠(53.3%)的TT4水平高于参考范围上限,7只小鼠(46.7%)的TRAb值高于参考范围上限,2只小鼠(13.3%)的TT4水平、TRAb值都高于参考范围上限。结论1.GO患者眼眶结缔组织中成纤维细胞高表达CD40、ICAM-1,原代培养眼眶成纤维细胞表面表达CD40、ICAM-1。2.GO患者眼眶成纤维细胞经CD40L激活后,可以高水平的表达ICAM-1。3.眼眶成纤维细胞经CD40L刺激后,MAPK (ERK1/2,p38,JNK)信号通路被激活发生磷酸化改变,其中ERK1/2和JNK磷酸化后信号转导至NF-κB,发生核转位,启动ICAM-1的基因表达;而p38MAPK磷酸化后信号转导至一个未知的核转录因子,调控ICAM-1的基因表达。4.眼眶成纤维细胞经CD40L激活后,Syk激酶磷酸化后发挥酶的活性,诱导MAPK (ERK1/2,p38,JNK)信号通路被激活发生磷酸化改变。5.用pEGFP-C2-TSHR质粒免疫BALB/c小鼠所构建的Graves病动物模型与人类Graves病的组织学特征非常接近,是一种可行、有效的方法。