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沙门菌是一种常见的人兽共患致病菌,给养殖业带来了巨大的损失。流行病学研究表明,国内规模化养鸡场沙门菌感染的优势血清型是肠炎沙门菌和鸡白痢沙门菌。本实验室前期建立的检测D群沙门菌抗体的O9单抗竞争ELISA方法虽然可以快速、高效地检测这两种沙门菌感染,但无法进一步区分。研究表明,基于H抗原特异性抗体的检测方法可以解决这一难题。因此,本研究在已有肠炎沙门菌H:g抗原单抗的基础上,通过条件的优化,建立了快速检测肠炎沙门菌抗体的竞争ELISA方法。并且发现,该方法与O9单抗竞争ELISA的联合使用,可以有效鉴别区分鸡白痢沙门菌的感染,为鸡白痢沙门菌净化提供技术支撑。1.沙门菌H:g抗原单抗竞争ELISA方法的建立以本实验室制备的12E3杂交瘤细胞制备腹水单抗,经纯化标记后,其效价为32000。同时,应用酸解法提取肠炎沙门菌鞭毛蛋白作为包被抗原。采用方阵滴定法确定竞争ELISA方法中抗原的最适包被浓度为5.8 μg/mL,酶标抗体的最适使用浓度为0.5 μg/mL。在此基础上,确定待测血清的最适稀释度为1:8。经过一系列实验条件的优化,确定检测条件:以PBS作为抗原包被液,4℃包被20h;以含5%脱脂奶的PBS溶液作为封闭液,37℃封闭3 h;酶标单抗37℃作用0.5 h;37℃显色10 min。通过ROC曲线法确定检测阈值,样品抑制率>35%为阳性,反之则为阴性。在此检测标准下,该方法的检测限为0.56μg/mL且重复性较好。同时,利用该方法检测鸡群中常见血清型沙门菌和其他病原感染血清表明,肠炎沙门菌感染血清与其它血清不存在交叉反应。通过检测132份肠炎沙门菌感染血清和136份SPF鸡血清表明,该方法的特异性和敏感性分别达到96.97%和97.79%。综上所述,该方法稳定性良好,特异性和敏感性较强,可以用于肠炎沙门菌抗体的检测。2.沙门菌H:g抗原单抗竞争ELISA试剂盒的组装与应用经比较分析发现,使用Liquid Plate Sealer和Candor公司的保护剂,试剂盒可以在37℃储存25天。该试剂盒在4℃保存300天后,仍具有较好的稳定性。比较分析表明,该试剂盒与美国IDEXX公司的试剂盒检测结果的符合率达到97%,与玻板凝集实验的符合率达到97.8%。单盲实验结果表明,该试剂盒能有效区分鸡白痢和肠炎沙门菌的感染。应用该试剂盒检测来自江苏两个不同养殖场的894份血清样品发现,蛋鸡养殖场的阳性率为4%,肉鸡养殖场为1.16%。此外,在77份肠炎沙门菌感染血清和65份鸡白痢沙门菌感染血清中,O9单抗竞争ELISA试剂盒共检测到139份阳性血清,检出率为98.5%;而H:g单抗竞争ELISA检测发现,肠炎沙门菌感染血清均为阳性,鸡白痢沙门菌感染血清均为阴性。可见,该试剂盒与O9单抗竞争ELISA试剂盒联用可以有效甄别鸡白痢沙门菌感染。综上所述,该试剂盒可以为肠炎沙门菌的防控和鸡白痢沙门菌的净化提供技术支持。