人类基因组计划的完成,宣告了“后基因组时代”的到来,对新蛋白的生物学功能研究成为了当前的热点。hNTKL-BP1基因是本实验室从人胎盘cDNA文库中克隆得到的一个新基因。本论文对hNTKL-BP1蛋白及其相互作用蛋白hPirh2的功能进行了初步研究。 通过RT-PCR实验,我们发现hNTKL-BP1基因在16种成人组织中广泛表达,在心脏、肝脏、胰腺、脾胸腺、和前列腺中表达量较高。Northern杂交结果显示hNTKL-BP1基因具有两种大小不同的剪接本。我们又从人胎肝cDNA文库中克隆得到了较小的剪接本hNTKL-BP2,并对两种剪接本所编码蛋白的结构和细胞定位进行了比较。hNTKL-BP1和hNTKL-BP2的C端结构的差异和细胞定位的不同预示了两者在细胞中行使不同的生物学功能。生物信息学分析发现,hNTKL-BP1与Dynatin家族成员有一定相似性,尽管酵母系统的功能互补实验表明hNTKL-BP1并不具有与酵母中Dynatin家族成员nip100相同或相似的功能,但我们发现hNTKL-BP1的过量表达对酵母细胞的生长有一定的抑制作用。并且,细胞集落形成实验、细胞生长曲线检测和裸鼠荷瘤实验结果都显示hNTKL-BP1蛋白的过量表达可以明显抑制肝癌细胞SMMC 7721的生长和体内的成瘤。我们通过FACS实验和Atlas System实验进一步分析了hNTKL-BP1对细胞周期的影响,发现hNTKL-BP1通过对细胞G2-M期的影响抑制细胞生长,并且hNTKL-BP1的过量表达引起三个与细胞增殖相关基因表达的下调。这暗示了hNTKL-BP1很可能是一种细胞分裂周期的调节因子,参与了细胞周期不同时期转换的调控,它的表达异常会直接影响细胞的增殖。本文对新蛋白hNTKL-BP1的发现和功能研究有可能为肿瘤的基因治疗开辟新的途径,我们相信对hNTKL-BP1蛋白的深入研究将会有很好的应用前景。 我们通过酵母双杂交实验得到两个能够与hNTKL-BP1发生相互作用的蛋白:hNTKL和hPirh2。hNTKL的N端含有一个激酶样结构域,因此,hNTKL可能通过与hNTKL-BP1的相互作用影响其磷酸化水平。hPirh2被报道具有泛素连接酶活性,能够与p53相结合,促进其泛素化,并能抑制p53的功能。我们通过体外结合实验、免疫共沉淀实验和亚细胞免疫荧光共定位实验证实了hPirh2与hNTKL-BP1之间的特异性相互作用,并且通过体外实验发现hPirh2能够催化hNTKL-BP1的泛素化。因此,hNTKL-BP1很有可能是hPirh2的一个新底物,细胞通过hPirh2对hNTKL-BP1的泛素化,来调节hNTKL-BP1在胞内的蛋白质水平。hNTKL和hPirh2