目的:卵巢癌是女性生殖系统的常见恶性肿瘤之一,是致死率最高的女性生殖系统恶性肿瘤,常伴发腹膜转移,约70%的卵巢癌患者诊断时已经发生了广泛的腹膜转移,严重制约了卵巢癌患者的预后,然而卵巢癌腹膜转移的潜在机制目前尚不明确,因此深入研究卵巢癌腹膜转移的发生、发展过程,阐明其分子病理学机制,寻找关键的治疗靶点,是进一步提高中晚期卵巢癌患者术后生存率的根本途径。卵巢癌的腹膜转移是卵巢癌细胞与腹膜微环境共同作用的结果,现有的研究多从卵巢癌细胞发展的角度探讨腹膜转移的机制,而有关腹膜微环境变化在腹膜转移中作用的研究甚少。间皮细胞是腹膜微环境的重要组成部分,本研究着力于腹膜微环境的改变,从间皮细胞的成纤维转化入手,探讨卵巢癌腹膜转移的相关机制。研究方法:病人和标本:本研究是由中国医科大学的地方机构审查委员会批准开展的,组织标本来自60例2016-2017年间在中国医科大学附属盛京医院手术的病人。本研究选取了40例腹膜转移卵巢癌患者的腹膜转移癌旁腹膜及20例正常腹膜,采用光学显微镜和电子显微镜,对正常腹膜的间皮细胞及卵巢癌转移的腹膜间皮细胞进行观察,包括间皮细胞的形态和排列,从形态学角度验证卵巢癌腹膜转移患者的腹膜中存在着间皮细胞的成纤维转化;采用Western-blot法检测间皮细胞E-cadherin,α-SMA(Smooth muscle anctin)的表达变化,检测用无血清培养基培养的人间皮细胞系HMrSV5、用正常培养基培养的HMrSV5以及用卵巢癌细胞系SKOV3上清培养后的间皮细胞HMrSV5中上皮源性标记E-cadherin和间质转化标记α-SMA的表达,从蛋白水平对间皮细胞的成纤维转化进行进一步验证;采用ELISA(enzyme-linked immunosorbentassay)方法检测卵巢癌细胞系SKOV3和HO8910上清中TGF-β1、IL-10、IL-8、TNF-α、VEGF、EGF、MMPs的表达水平,寻找可能引起间皮细胞成纤维转化的细胞因子,为构建模型间皮细胞奠定基础;体外实验构建间皮细胞成纤维转化的模型,确定TGF-β1作用的最佳浓度及作用时间;采用MTT细胞增殖实验和Transwell细胞侵袭实验考察间皮细胞成纤维转化促进卵巢癌细胞增殖和转移的能力;采用ELISA方法检测正常间皮细胞及模型间皮细胞上清中的相关趋化因子(CXCL12、CXCL16、CCL19、CCL21)浓度;分析模型间皮细胞上清中相关趋化因子的表达情况,同时采用Western-blot检测无血清培养基、正常培养基培养的卵巢癌细胞SKOV3及模型间皮细胞上清培养后的SKOV3中趋化因子受体CXCR4、CXCR6、CCR7的表达,探讨模型间皮细胞促进卵巢癌细胞转移的相关机制。结果:1.无转移及良性病变的腹膜标本,光镜下显示腹膜表面被覆单层间皮细胞,细胞扁平或立方,排列紧密,而在腹膜转移阳性的进展期卵巢癌腹膜中,腹膜间皮细胞或完全脱失,无法判断间皮细胞的形态,或间皮细胞形态呈长梭形,表面覆有粉染的纤维素,部分间皮细胞脱落,裸区形成。正常腹膜于扫描电镜下观察,可见正常腹膜中间皮细胞排列紧密,而腹膜转移阳性的患者腹膜结构,在电镜下可见到间皮细胞发生损伤及纤维化,细胞形态变梭,细胞间间隙变大,裸区形成;Wesern-blot检测显示与用无血清培养基和正常培养基培养的间皮细胞系HMrSV5相比,卵巢癌细胞系SKOV3上清培养后的HMrSV5中E-cadherin表达显著下调,α-SMA表达显著上调,呈现成纤维转化的蛋白表型。2.ELISA的方法检测卵巢癌细胞系SKOV3和HO8910上清中TGF-β1、IL-10、IL-8、TNF-α、VEGF、EGF、MMPs的浓度,结果显示,在两种卵巢癌细胞系的上清中,TGF-β1和IL-10出现了较高水平的表达。3.体外细胞学实验观察到,TGF-β1可以刺激间皮细胞发生成纤维转化的形态学改变,Wesern-blot验证了TGF-β1具有诱导间皮细胞成纤维转化的作用并具有时间和剂量依赖性。4.MTT细胞增殖实验结果显示间皮细胞成纤维转化后上清能够促进卵巢癌细胞的增殖,采用MFT模型的上清培养基(实验组),正常间皮细胞培养基以及普通无血清培养基(对照组),分别培养卵巢癌细胞SKOV3和HO8910,正常间皮细胞培养基以及普通无血清培养基培养48h后SKOV3的细胞增殖速度没有差异,生存率分别达到81.3±3.6%和78.6±2.3%,p=1.398。而MFT模型的上清培养基培养的SKOV3增殖速度较快,48h生存率达到99.6±4.2%,与前两者相比,p<0.05。在另一种卵巢癌细胞系中也观察到同样的现象。正常间皮细胞培养基以及普通无血清培养基培养48h后的HO8910细胞增殖速度没有差异,生存率分别达到75.3±3.1%和70.6±1.3%,p=1.472。而MFT模型的上清培养基培养的HO8910增殖速度较快,48h生存率达到97.3±3.9%,与前两者相比,p<0.05。5.以无血清培养基培养的间皮细胞为对照组,以TGF-β1处理构建的模型间皮细胞及卵巢癌上清培养的间皮细胞为实验组,采用SKOV3细胞系进行Transwell侵袭实验,结果显示,与对照组相比,两个实验组癌细胞的侵袭数量显著增高,差异有统计学意义(P<0.05)。TGF-β1处理的模型间皮细胞组癌细胞侵袭数量略高于卵巢癌上清处理的实验组,差异无统计学意义(P>0.05)。6.ELISA的方法检测了无血清培养基培养的间皮细胞(对照组)和模型间皮细胞(实验组)上清中几种卵巢癌相关趋化因子CXCL12、CXCL16、CCL19、CCL21的表达,结果显示,与对照组相比,实验组上清中存在CXCL12和CXCL16的高表达,差异有统计学意义(P<0.05),CCL19和CCL21也较对照组有较高的表达,但差异无统计学意义(P>0.05)。同时,采用Western-blot的方法检测了分别无血清培养基及正常培养基培养的卵巢癌细胞SKOV3(对照组)和用模型间皮细胞上清培养的SKOV3(实验组)中趋化因子受体CXCR4、CXCR6、CCR7的表达情况,结果显示,与对照组相比,实验组中CXCR4、CXCR6的蛋白表达出现了显著增高(P<0.05),而CCR7未出现差异表达(P>0.05)。结论:1.通过光镜和电镜的组织形态学观察,证实卵巢癌转移的腹膜标本中,存在着腹膜间皮细胞的成纤维转化,是卵巢癌腹膜转移过程中腹膜微环境的重要改变,并采用细胞学实验,从蛋白水平验证了间皮细胞成纤维转化的改变,提示间皮细胞成纤维转化可能在卵巢癌腹膜转移中发挥了重要的作用。2.通过检测卵巢癌细胞系上清中多种细胞因子,发现卵巢癌细胞系上清中存在TGF-β1的高表达,提示卵巢癌细胞的微环境中存在着促进间皮细胞成纤维转化的因素。3.通过细胞形态学观察和蛋白水平的检测,证实TGF-β1能够促进间皮细胞发生成纤维转化。4.细胞增殖和侵袭实验结果显示间皮细胞成纤维转化促进了卵巢癌细胞的增殖和侵袭,提示腹膜微环境中间皮细胞的成纤维转化在卵巢癌腹膜转移过程中扮演了重要的角色。5.细胞学实验结果显示间皮细胞成纤维转化后能够促进微环境中趋化因子CXCL12和CXCL16表达增多,提示趋化作用可能是卵巢癌腹膜转移中的重要机制。6.细胞学实验结果显示间皮细胞成纤维转化后的微环境促进了卵巢癌细胞中趋化因子受体CXCR4和CXCR6表达增多,提示CXCL12-CXCR4、CXCL16-CXCR6两条信号通路可能是间皮细胞成纤维转化促进卵巢癌细胞增殖转移的潜在机制,未来可能成为抑制卵巢癌腹膜转移的重要治疗靶点。