目的 胰腺移植术后经常并发急性胰腺炎，其原因主要是继发于冷保存后的缺血—再灌注损伤。再灌注期间，上皮细胞功能障碍，内源酶激活，白细胞聚集并活化，都会导致氧自由基的产生。一氧化氮（NO）是一种反应性极强的自由基，兼有第二信使和神经递质的功能，它可被氧化成硝酸盐和亚硝酸盐；此外它还可以丢失一个电子变成NO⁺，进而与过氧化物基团结合形成过氧化亚硝酸盐(ONOO^-·)，这是一种活性相当高的自由基，具有非常强烈的细胞毒性作用。同时，NO具有显著舒张血管的功能，可以缓解移植物血管发生的痉挛，减少血管危象的发生，这些对于术后血栓形成及移植后胰腺炎的发生都有预防作用。因此，在胰腺移植的缺血一再灌注损伤中，NO的作用是一把“双刃剑”，如何利用其有益的作用并避免其损害，一直是医学家研究的热门。目前已知，NO由一氧化氮合酶（NO synthase，NOS），以分子氧和L-精氨酸为底物合成。NOS包括结构型NOS（cNOS）表达在内皮细胞和神经元上，以及诱导型NOS（iNOS），其中起病理作用的主要是iNOS。本实验的目的是，研究大鼠胰腺缺血—再灌注过程中NOS各种亚型的表达情况，以及应用选择性iNOS抑制剂能否防止再灌注期间急性胰腺炎的发生。 实验材料与方法 实验材料 雄性Wistar大鼠，体重250±20克，购自中国医科大学实验动物中心，随机分为三组：对照组（sham），假手术，仅游离胃脾韧带和腹腔动脉；缺血再灌注组（I/R），夹闭脾动脉造成胰腺体尾部缺血，30分种后开放，恢复灌注之前，经阴茎背静脉注人与实验组等量的生理盐水，分别于再灌注后0、2、4、6、12、24小时处死动物，并迅速开腹取胰腺;氨基肌处理组（AG），缺血30分钟后，恢复灌注之前，经阴茎背静脉注人盐酸氨基肌溶液，剂量分别为40、60、80m岁kg体重，再灌注4、6小时后处死动物，并迅速开腹取胰腺。将胰腺标本分为2部分，一部分放人10%PBS福尔马林溶液中固定，另一部分深低温冰箱一70℃保存。所采集的血液不经抗凝，2000转/分离心10分钟，取血清一20℃冻存。实验方法 一、硝酸还原酶法检测血清中NO水平。 二、碘一淀粉比色法检测血清中的淀粉酶的活力。 三、使用N 05测定试剂盒分别检测胰腺组织中cNOS和iNOS活性。 四、HE染色:按照标准步骤，将胰腺放人10%福尔马林溶液中固定，酒精梯度脱水，二甲二清洗，石蜡包埋，然后将石蜡块制成4微米的切片，苏木素一伊红东己，光学显微镜下观察。 五、免疫组织化学染色:第一抗体为兔抗大鼠iNOS的多克隆抗体，SABC试剂盒染色。 六、统计学分析:使用SPSS软件系统对实验结果进行统计学分析，连续数据以平均值土标准差表示，对各组间差异进行方差分析。结果 一、血清NO水平:缺血再灌注4小时后，血清NO水平明显升高，远高于正常水平，达到最高值，随着再灌注时间延长，NO水平降至正常。使用氨基肌后，血清NO水平明显低于对照的非治疗组，在正常范围内。 二、血清淀粉酶活性:缺血再灌注后血清淀粉酶活性均显著升高，其中以再灌注4、6、12、24小时组升高更为明显。使用氨基肌后，血清淀粉酶活性均明显低于对照非治疗组。 三、胰腺组织NOS活性:胰腺缺血再灌注4小时后，iNOS活性显著增强，而cNOS活性没有变化;使用氨基肌后，iNOS活性明显下降，而CNOS仍无变化。 四、病理改变:再灌注6小时后‘，UR组开始出现胰腺损伤的表现;使用氨基肌后，再灌注6小时未见胰腺组织明显损害表现。 五、免疫组织化学:再灌注4小时后，FR组发现iNOS强阳性染色，使用氨基脏后，组织中未见iNOS阳性染色。讨论 胰腺移植是为胰岛素依赖型糖尿病病人提供附加的胰腺，以替代已丧失胰岛素分泌功能的自身胰腺，术后能生理性调节胰岛素分泌，这是目前其它任何方法所不可能达到的。影响移植术后移植物功能的主要因素包括移植后胰腺炎和排斥反应等问题，处理往往极为困难，预后较差。胰腺移植术后胰腺炎的发病率为3一60%，其原因主要是继发于冷保存后的缺血一再灌注损伤。再灌注期间，上皮细胞功能障碍，内源酶激活，白细胞聚集并活化，都会导致氧源性自由基的产生。 一氧化氮（NO）是一种反应性极强的自由基，由于分子非常小，可以自由的穿透细胞膜，作用于细胞内靶分子。催化NO合成的酶称为一氧化氮合酶（NO synthase，NOS），以分子氧和L一精氨酸为底物合成NO。目前已确定的NOS有三种，基于原型酶的细胞或组织来源以及表达方式，分别称为神经元型NOS（neuron欲NOS，研05）、诱导型NOS（indueible NOS，iNOS）和内皮型NOS（endothelid NOS，eNOS）。nNOS和eNOS在细胞处于生理状态下即有表达，合称为结构型N0S（ cNOS），而iNOS在正常生理情况下基本不表达。iNOS产生一氧化氮的能力比cNOS强几个数量级，所以有着非常重要的病理作用。 NO能够作用于琉基，使与能量代谢或抗氧化有关的酶（如谷耽甘肤过氧化物酶）失活，此反应需要高浓度NO长时间作用，很可能由iNOS介导。NO还可以丢失一个电子?