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从自然环境、人畜食品、健康动物胃肠道内容物等样品中选育有益乳酸芽孢杆菌,并对其进行培养条件的优化,为乳酸芽孢杆菌类微生态制剂的研发奠定基础。
用添加溴甲酚紫指示剂的GYP平板从67样品中分离出41株产酸芽孢杆菌,通过高效液相色谱检测、抑菌试验和芽孢形成数试验,从中筛选出SC株、SL1株、TR株等三株性能优良的产乳酸芽孢杆菌。通过Biolog微生物自动鉴定系统、16SrRNA碱基序列分析,对三株菌进行种属关系的分析鉴定。鉴定结果是:SC株株为乳酸芽孢杆菌SC(暂命名),TR株为乳酸芽孢杆菌TR(暂命名),SL1株为蜡状芽孢杆菌。
选用乳酸芽孢杆菌SC作为出发菌株,以紫外线、亚硝基胍作诱变物,以不同的浓度和作用时间对SC株进行复合诱变;诱变培养后,挑选出200株诱变株,比较它们的产酸、抑菌活性和芽孢形成率等三方面的性能,最终筛选得到一株芽孢形成率符合要求,产酸能力和抑菌活性均有提高的正向突变株,即乳酸芽孢杆菌SC27株。用SC27株培养物对5组昆明系SPF小鼠进行急性毒性试验,将培养物按10、5、2.5、1.25、0.625g/kg五种剂量分别给小鼠灌胃染毒,并记录每天情况。整个试验过程中无小鼠死亡,小鼠亦无病理解剖学变化。
稳定性试验的结果表明,SC27株具有较好的热稳定性,在湿热处理中,当温度达到100℃、作用时间在20min以上时,活菌数才下降一个数量级。在干热处理中,在80℃、40min和100℃、60min的时候显示该活菌数为零,而其它不同温度和不同处理时间均不能使该活菌数下降一个数量级;同时,SC27株对pH值2.2~7.0具有很好的耐受性,说明具有较强的耐酸性;但该菌株对多数抗生素较为敏感。
通过乳酸芽孢杆菌SC27的体外抑菌试验,表明该菌的培养物对金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏杆菌等五种革兰氏阳性、阴性指示菌有明显的抑制作用;另外,试验结果显示SC27株培养物的抑菌物质具有较好的热稳定性,受木瓜蛋白酶、蛋白酶K、胰蛋白酶的影响较小。
在培养条件的探索上,以pH值、芽孢产生总数、芽孢形成率作参考指标并考虑培养基成本的问题,比较筛选出适宜该菌生长的碳源、氮源,在此基础上进一步考虑添加对乳酸和芽孢形成有利的金属离子,利用正交试验设计,对SC27株进行培养条件的优化。最终得出培养基的优化组合是:黄豆汁0.5%、甘蔗汁13%、K2HPO40.05‰、MgSO40.05‰、MnSO40.02‰;其培养条件的优化组合是:发酵温度为37℃;接种量为10%;装液量为40mL/250mL;先摇床120r/min培养24h,再转入静置培养96h。
本研究选育出了一株能发酵产生乳酸、芽孢形成率较高、对热和酸稳定、有较强抑菌活性的有益乳酸芽孢杆菌,即乳酸芽孢杆菌SC27,并优化出了适合其生长的培养基和培养条件。