【摘 要】
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目的:牙周组织再生对于修复牙周软硬组织缺损来说具有重要意义,而选取合适的种子细胞是实现良好再生的前提。近年来,牙源性间充质干细胞（Dental-derived mesenchymal stem cells,DMSCs）的发现及应用使牙周组织再生取得了关键进展,这些干细胞主要来源于牙龈、牙髓、牙周膜、脱落的乳牙、根尖乳头及牙囊组织。而在诸多细胞中,人牙龈干细胞（Human gingival mese
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目的:牙周组织再生对于修复牙周软硬组织缺损来说具有重要意义,而选取合适的种子细胞是实现良好再生的前提。近年来,牙源性间充质干细胞（Dental-derived mesenchymal stem cells,DMSCs）的发现及应用使牙周组织再生取得了关键进展,这些干细胞主要来源于牙龈、牙髓、牙周膜、脱落的乳牙、根尖乳头及牙囊组织。而在诸多细胞中,人牙龈干细胞（Human gingival mesenchymal stem cells,h GMSCs）,人牙髓干细胞（Human dental pulp stem cells,h DPSCs）及人牙周膜干细胞（Human periodontal ligament stem cells,h PDLSCs）是三种最易获得的牙源性干细胞。此外,口腔内炎症微环境在很大程度上影响组织再生的效果。肿瘤坏死因子-α（Tumour necrosis factor-α,TNF-α）是一种促炎因子,其被认为是口腔内典型的炎症物质,但特定浓度的TNF-α对h GMSCs、h DPSCs及h PDLSCs增殖分化影响的比较尚无定论。因此本实验通过比较上述三种牙源性间充质干细胞的增殖分化能力并探讨TNF-α对三者生物学活性的影响,进而为牙周组织再生过程中种子细胞的选取及优化提供策略。方法:1.h GMSCs、h DPSCs及h PDLSCs的分离培养:选取18-25岁患者因正畸或阻生等原因需拔除的第三磨牙（要求无龋,无牙周牙髓病,无隐裂的健康恒牙）及阻生齿拔除术中需要切除的废弃牙龈,在超净工作台下,将牙龈组织浸在PBS中,刮取与牙龈组织同一供体来源的牙齿根中1/3处的牙周膜,并用无菌拔髓针取出完整牙髓,通过组织块法对三种干细胞进行原代培养,传代至3-5代用于实验;2.h GMSCs、h DPSCs及h PDLSCs的鉴定:采用流式细胞术对三种细胞的干细胞特异性表面标志物进行鉴定;3.h GMSCs、h DPSCs和h PDLSCs的增殖情况:采用CCK-8检测试剂盒分别测定正常和含TNF-α（10ng/m L）的培养基中三种干细胞在不同时间（0h、24h、48h、72h、96h、120h、144h、168h）的吸光光度值（Optical density,OD值）,并绘制增殖曲线;4.h GMSCs、h DPSCs及h PDLSCs的成骨成脂情况:在正常和含TNF-α（10ng/m L）的成骨、成脂诱导液中分别培养7天后,采用碱性磷酸酶染色试剂盒、检测试剂盒对三种干细胞的ALP进行定性和定量检测;21天后通过茜素红染色测定成骨情况,油红O染色测定成脂情况。结果:1.采用组织块法成功培养出同一供体来源的原代h GMSCs、h DPSCs及h PDLSCs,并能稳定传代至P3-P5;三种干细胞均具有自我更新能力,可表达干细胞的特异性表面标志物,在特定环境下可分化为成骨和成脂细胞,故符合间充质干细胞的标准。2.将三种干细胞进行增殖、成骨、成脂能力的综合比较,结果显示:三者中h GMSCs的增殖及成脂能力最强（P＜0.05）,h PDLSCs的成骨能力最强（P＜0.05）,h DPSCs在增殖及分化方面表现居中。3.TNF-α（10ng/m L）对三种干细胞的增殖分化能力均有不同程度抑制作用。h PDLSCs受抑制作用最明显（P＜0.05）,h GMSCs受抑制影响最小（P＜0.05）。结论:1.h GMSCs、h DPSCs、h PDLSCs在体外均具有增殖分化能力。2.10ng/m L的TNF-α对h GMSCs、h DPSCs、h PDLSCs的增殖、成骨及成脂均具有不同程度抑制作用。3.三者比较而言,h PDLSCs更适用于骨再生研究,但需提高其抵御炎症的能力;对于h GMSCs,在应用过程中要设法提高其分化能力。
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