肝癌人对类的健康有严重威胁,预后差,治疗效果差,是一种致命性肿瘤。因此深入的研究肝癌的发生、发展机制,对加强肝癌的预防和治疗具有重要的意义。在基因组定位中,CyclinD1基因被定位于11q13,是由295个氨基酸残基编码组成的蛋白质,全长约15kb。该蛋白质的蛋白分子量约为36kb。CyclinD1基因的作用机制是：CyclinD1可以通过激活CDK4导致pRb磷酸化,核转录因子E2F被释放出来,促使DNA在细胞核内复制,使细胞迅速通过G1期进入S期,结果导致了细胞的恶性增殖。MiRNAs是一类长度约为18-25核苷酸组成的单链、内源性、高度保守的非蛋白质编码小分子RNA。现代研究发现,动植物体内具有多种miRNAs,其功能主要功能是通过抑制蛋白质的翻译或者降解目标mRNA,参与调节细胞生长、分化、凋亡与增殖：与机体代谢、个体发育等多种疾病的发生发展有着密切的关系。研究表明,miRNA可以在比较长的时间内稳定的存在于人类及动物的唾液、血液、尿液等体液中,具有调控细胞分化、发育、凋亡及增殖等作用。某些miRNAs具有抑制肿瘤的作用,某些miRNAs具有促进肿瘤发生的作用参与肿瘤的演变与形成[14-16]。已有研究证实,miR-145在肿瘤中是抑癌基因,在肝癌细胞系中异常表达,并且在人类肿瘤的发生发展过程中占据重要作用。在分子生物学的研究领域,我们已经认识到表遗传学(Epigenetics)的改变往往是由肿瘤基因的转录调控导致的；我们越来越重视这种不改变基因编码序列,并且是可逆的表遗传学调节。大量的研究表明,肿瘤的发生是由多种肿瘤基因、肿瘤抑制基因的功能改变组成的多步骤过程,表遗传学或／和遗传学的改变都可以引起肿瘤的发生。恶性肿瘤的发生一般都伴有肿瘤抑制基因的功能丧失。由DNMT3b催化完成的DNA启动子区甲基化是DNA的一种重要的修饰方法,是表遗传学重要内容,DNA甲基化的修饰在基因的表达调控、X染色体失活、基因组印记、胚胎发育调节及肿瘤的发生等许多方面发挥着重要的作用。DNMT3b是DNMTs家族中作用最重要的一员。在未分化的胚胎干细胞可以检测到DNMT3b的大量表达,主要催化DNA的甲基化,在正常人体的细胞中表达量很低。DNA甲基化调控主要通过改变基因启动子区域的CPG岛的甲基化状态实现。基因启动子区域有大约50%的CPG岛位。在正常细胞中,位于基因启动子区域的大部分CPG岛是低甲基化状态。在恶性肿瘤细胞中,DNMT3b的高表达可以使某些肿瘤抑制基因启动子区CPG岛处于高甲基化状态,进而使该基因功能沉默,从而引起了肿瘤的发生。本实验中发现,在肝癌细胞系中,Cyclin-D1基因(一重要的癌基因)的表达明显升高,我们采用siRNA技术抑制DNMT3b的表达后,Cyclin-D1基因的表达同时降低,在这一过程中,Cyclin-D1基因的启动子区域CpG岛甲基化状态不变。在这一过程中,如果DNMT3b通过甲基转移酶的作用的话,那么抑制DNMT3b的表达应该使CyclinD1基因表达应该升高,而我们实验发现,在此过程中,CyclinD1基因表达是降低的,而其启动子区的甲基化水平不变。那么究竟是什么原因引起了CyclinD1基因表达的改变呢?本实验将对此问题作出回答。第一部分：方法1、通过细胞培养技术培养SMMC7721细胞；将DNMT3b siRNA(终浓度为50nnM)转染到肝癌细胞系SMMC7721中；2、研究分组研究分为转染control siRNA的对照组和转染DNMT3b siRNA的实验组。3、siRNA转染将常规培养的SMMC-7721细胞进行传代,接种于六孔板上；然后进行转染。4、用日本Nikon公司显微荧光摄像/照相系统检测荧光素标记的对照siRNA在SMMC7721细胞中的转染效率并照相。5、转染后48h分别提取两组细胞的基因组DNA。提取总蛋白。6、用Western blotting方法检测DNMT3b和CyclinD 1在转染前后的表达变化。7、甲基化特异性PCR (MS-PCR)检测转染前后CyclinD 1基因组启动子区DNA的甲基化状态的变化。结果1、肝癌细胞在转染后被显著抑制。将荧光素标记的对照siRNA,在同样条件下转染到SMMC7721细胞中,置37℃、5%CO2孵育箱内培养48h,通过荧光显微镜观察转染效率,siRNA转染肝癌细胞的效率可达90%以上。2、用Western blotting方法检测DNMT3b和CyclinD 1显示转染siRNA后,实验组的DNMT3b和CyclinD的表达水平明显低降,而对照组和正常组DNMT3b和CyclinD 1的表达水平无明显差异。3、通过MTT实验,在转染DNMT3b siRNA后实验组和对照组细胞的增殖活性在48和72小时均有显著性差异。4、流式细胞仪检测SMMC7721细胞在转染DNMT3b siRNA的实验组细胞处于G0/G1期的细胞数明显多于对照组细胞,同时S期的细胞则明显减少。5、实验组与对照组细胞中CyclinD 1基因均表现为低甲基化,甲基化状态无明显差异,M引物未扩增出目的片段,U引物扩增出目的片段,两组细胞中CyclinD 1基因甲基化状态未发生改变。第二部分方法1、SMMC7721细胞培养后转染DNMT3bsiRNA,2、转染后48h分别提取两组细胞的基因组DNA及总RNA。3、用RT-PCR检测转染前后miR- 145RNA以及CyclinD1mRNA的表达变化。4、检测转染前后miR-145基因组启动子区DNA的甲基化状态的变化。结果1、我们看到实验组miR-145RNA在转染前低表达,转染后miR-145RNA高表达；在对照组转染前后miR-145RNA的表达状态不变,均为低表达。实验组对照组在转染前、转染后CyclinD1 mRNA的表达均未发生明显改变,均为高表达。2、实验组与对照组细胞中miR-145基因均表现为低甲基化,甲基化状态无明显差异,M引物未扩增出目的片段,U引物扩增出目的片段,两组细胞中miR-145基因甲基化状态未发生改变。结论DNMT3b siRNA可以特异地抑制DNMT3b的表达。DNMT3b可以通过调控miR-145的表达,进而调控CyclinD1基因表达。该过程中miR-145基因及CyclinD1基因的启动子区甲基化状态未发生改变。这说明DNMT3b在此过程中并未发挥DNA甲基转移酶的作用。DNMT3b的表达变化通过引起miR-145的高表达进而导致细胞周期蛋白CyclinD1的低表达,使肿瘤细胞停滞在G1期,从而抑制肝癌细胞的生长、增殖,表明DNMT3b可以成为肝癌基因治疗中的一个重要分子靶点。