目的程序性细胞死亡,又称为细胞凋亡,在生物体发育过程中具有很重要的作用。程序性细胞死亡因子4(programmed cell death 4, PDCD4)最初是在小鼠体内发现的在细胞凋亡中表达上调的基因,后来陆续在鸡、大鼠、人类中发现给基因的同源物。目前对于该基因在细胞凋亡中所起到的具体作用和机制尚不清楚。进一步的研究发现,PDCD4在肿瘤发生发展中起到重要作用,目前的证据说明PDCD4是一个新的抑癌基因,可以作为一个抗肿瘤治疗中潜在的靶基因。PDCD4可以抑制蛋白的转录和翻译,进而抑制肿瘤细胞的生长。近来,我们和其他学者在神经胶质瘤、肺癌、结肠癌、肝癌、卵巢癌等肿瘤中发现PDCD4表达水平的下调甚至缺失,进一步的研究发现,在神经胶质瘤、卵巢癌、肺癌、结肠癌中PDCD4表达的下调或者缺失与肿瘤的发生发展以及患者的预后密切相关。人PDCD4的表达在不同水平上受多种不同因素的调节。在翻译水平上,miRNA-21对于PDCD4表达的调控是目前研究的热点。研究发现,miRNA-21特异结合PDCD4 mRNA 3 UTR,抑制PDCD4的翻译。miRNA-21是实体瘤中普遍高表达的microRNA,在不同肿瘤中均发现了miRNA-21与PDCD4表达的负相关。在蛋白质水平上,Akt和S6K1可以催化PDCD4蛋白发生磷酸化,从而促进其发生降解。综上,目前对于PDCD4调控的研究主要集中于转录后和翻译水平,对于人PDCD4转录水平的调控研究较少,本课题组在前期研究中发现PDCD45’端CpG岛甲基化是人神经胶质瘤中PDCD4转录缺失原因之一,但PDCD4转录调控的分子机制尚不清楚。由于抑癌基因的表达通常受到多种因素的调控,因此,本研究克隆、构建人PDCD4启动子萤火虫荧光素酶报告质粒并分析其活性,进一步确定其核心启动子区,并对其转录调控区进行初步研究,为进一步揭示人PDCD4基因的表达调控机制奠定基础。方法一、人PDCD4启动子全长的克隆及其启动活性的分析1、人PDCD4启动子区的预测为了克隆PDCD4的启动子,首先利用MatInspector、FirstEF、Proscan Prediction软件对人PDCD4基因5’端-2500～+500段(转录起始位点为+1)进行启动子区预测。2、人PDCD4启动子区克隆及报告质粒构建、鉴定结合启动子预测结果,选定长898bp的-548～+350片段,设计合适的引物,同时引入酶切位点KpnⅠ、BglⅡ,以人基因组DNA为模板进行PCR扩增。PCR产物双酶切后克隆入pGL4-Basic相应酶切位点,构建pGL4-PDCD4-P1,测序分析。3. RT-PCR和Western blotting检测内源性PDCD4在卵巢癌细胞系中的表达为了在细胞中检测PDCD4启动子的活性,我们分别采用RT-PCR和Western Blot法从RNA和蛋白质水平检测了PDCD4在4种卵巢癌细胞系中的表达状态,以筛选适合的细胞模型。Trizol法提取细胞总RNA,设计合适的引物进行RT-PCR检测；收集OVCAR3、SKOV3、3A0、CAOV3各约1×106个细胞,细胞裂解液破碎细胞提取总蛋白,Western Blotting检测PDCD4表达4、报告质粒的转染及双荧光活性分析为了检测PDCD4-P1的启动活性,我们从上述检测的细胞系中挑选出高表达PDCD4的OVCAR3和低表达PDCD4的SKOV3细胞系为代表,将上述构建的重组报告质粒pGL4-PDCD4-P1及pGL4-Basic(阴性对照)分别与pRL-TK(内参照)瞬时共转染OVCAR3、SKOV3细胞,24h收集细胞,对细胞粗提液进行双荧光素酶分析。按双荧光素酶报告基因检测试剂盒说明书将细胞裂解后与底物混合,用荧光计数仪检测所构建报告质粒中萤火虫荧光素酶活性M1与pRL-TK中海肾荧光素酶活性M2,M1／M2的比值即为目的片段的相对活性。每种质粒设2复孔,同一转染实验至少重复3次。二、PDCD4核心启动子的确定1、以pGL4-PDCD4-P1为模板构建一系列PDCD4-P1截短载体为了确定PDCD4核心启动子,对PDCD4-P1进行一系列截短。分别选定PDCD4基因-315～+350、+10～+350、-315～+1、-164～+1、-114～+1、-67～+1片段,以pGL4-PDCD4-P1为模板,PCR扩增,命名为P2 P3 P4 P5 P6 P7,亚克隆入pGL4-Basic载体构建相应截短载体。2、报告质粒的转染及双荧光活性分析将上述构建的报告质粒及pGL4-Basic(阴性对照)分别与pRL-TK(内参照)瞬时共转染卵巢癌细胞系OVCAR3、SKOV3,方法同上,每种质粒设2复孔,同一转染实验至少重复3次。三、人PDCD4的转录调控1、人PDCD4启动子区转录因子结合位点的预测与分析为了研究PDCD4转录调控机制,利用MatInspector软件对人PDCD4基因5’端-600～+400区进行转录因子结合位点分析2、PDCD4启动子截短载体的构建与双荧光素酶活性的检测为了研究PDCD4转录起始位点下游转录调控区,对PDCD4启动子区3’端进行截短,选定-548～+223、-315～+223片段,分别以PGL4-PDCD4-P1、P2为模板,PCR扩增,命名为PDCD4-P8、P9,克隆入pGL4-Basic载体构建pGL4-PDCD4-P8、P9,双酶切、测序鉴定。将上述构建的重组质粒和pGL4-Basic-P1、P2进行双荧光素酶检测,方法同上。每种质粒设2复孔,同一转染实验至少重复3次。3、构建PDCD43’端RREB结合位点截短载体以及RREB结合位点突变报告载体并进行双荧光素酶活性检测为了进一步研究转录因子RREB对PDCD4转录活性的影响,对PDCD4-P2 3’端RREB结合位点进行截短并构建报告质粒,同时构建RREB结合位点定点突变报告质粒。选定-315～+292片段,以pGL4-PDCD4-P2为模板,PCR扩增,命名为PDCD4-P10,克隆入pGL4-Basic载体构建pGL4-PDCD4-P10,双酶切测序鉴定；同时对pGL4-PDCD4-P1潜在的转录因子RREB(Ras反应元件结合蛋白)结合位点+296～+301段进行定点突变(GGTCCT→AAGCTT)。设计合适的引物,采用反向PCR的方法,将定点突变引入pGL4-PDCD4-P1,命名为pGL4-PDCD4-P1-RREB3mut将上述构建的重组质粒进行双荧光素酶检测,方法同上。每种质粒设2复孔,同一转染实验至少重复3次。结果一、人PDCD4启动子全长的克隆及其启动活性的分析1、软件预测初步确定了人PDCD4可能的启动子区为了确定PDCD4的启动子,我们用三个软件对其进行了预测。在线软件Matlnspector分析结果显示,-500～+191段为PDCD4启动子区,该区域含有4个转录因子SP1结合位点；FirstEF预测结果显示-262～+307段为启动子区；Proscan Prediction软件预测结果显示+25-+275段位启动子区。综合上述三个软件的分析结果,最终选定了包含所有预测结果的-548～+350段为假定人PDCD4启动子区,命名为PDCD4-P1。2、人PDCD4启动子区的克隆及报告质粒pGL4-PDCD4-P1构建、鉴定为了获得PDCD4启动子区PDCD4-P1,我们以正常人基因组DNA为模板,利用特异性引物对PDCD4-548～+350段进行PCR扩增,电泳结果显示一条PDCD4-P1(898bp)的特异DNA片段,目的片段电泳回收后,经KpnⅠ、BglⅡ双酶切,连接至pGL4-Basic载体的KpnⅠ、BglⅡ酶切位点间,连接产物经转化以及LA平板筛选后挑取单克隆菌落,碱变性法抽提重组质粒。对抽提的pGL4-PDCD4-P1质粒DNA进行KpnⅠ、BglⅡ双酶切,电泳可见898bp的目的片段和约4.2kb的载体大片段,证明构建成功。进一步的测序和BLAST结果显示DNA序列及插入方向正确,-365位点存在一个sNP位点(G／A)。3、不同卵巢癌细胞系PDCD4的表达情况为了找到合适的细胞模型,检测了不同卵巢癌细胞系PDCD4的表达情况。RT-PCR结果显示OVCAR3细胞系中PDCD4 mRNA表达较高,而其它三种细胞系低表达PDCD4 mRNA; Western blot结果显示OVCAR3细胞系高表达PDCD4蛋白,而SKOV3、CAOV3和3AO细胞系中PDCD4阳性条带亮度明显较弱。最终选用高表达内源性PDCD4的OVCAR3细胞和低表达PDCD4的SKOV3细胞作为双荧光素酶检测的靶细胞。4、报告质粒pGL4-PDCD4-Pl双荧光活性分析双荧光素酶分析证实,pGL4-PDCD4-P1在OVCAR3, SKOV3细胞系中均具有启动子活性,其M1／M2比值分别为pGL4-Basic空载体的67倍和15倍。其中,在高表达内源性PDCD4的OVCAR3细胞中,PDCD4-P1启动子活性明显高于低表达PDCD4的SKOV3细胞。该部分结果说明,PDCD4-P1已经包含具有启动活性的区段,PDCD4启动子克隆成功。二、PDCD4核心启动子的确定1、PDCD4-P1一系列截短片段的重组报告质粒构建成功为了确定PDCD4核心启动子,对PDCD4-P1进行一系列截短。分别选定PDCD4基因-315～+350、+10～+350、-315～+1、-164～+1、-114～+1、-67～+1片段,以pGL4-PDCD4-P1为模板,PCR扩增,命名为P2 P3 P4 P5 P6 P7,电泳结果均与预测相符。目的片段电泳回收后,经KpnⅠ、BglⅡ双酶切,连接至pGL4-Basic载体的相应酶切位点间,连接产物经转化以及LA平板筛选后挑取单克隆菌落,抽提重组质粒。KpnⅠ、BglⅡ双酶切结果以及测序结果均证实重组载体构建成功。2、报告质粒的双荧光活性分析及PDCD4核心启动子区的确定双荧光素酶结果显示,上述重组报告质粒在转染PDCD4高表达的OVCAR3细胞系后,P2(-315～+350)、P4(-315～+1)、P5(-164～+1)均具有较强的启动子活性,约为pGL4-Basic空载体的40倍左右,随着PDGD4 5’端的截短,P6(-114～+1)启动子活性开始下降,约为空载体的13倍,当截短到-67位点时,P7(-67～+1)启动活性完全丧失。P3(+10～+350)也没有启动子活性。转染内源性PDCD4低表达的SKOV3细胞系后,重组质粒双荧光素酶活性均较低但趋势保持一致。该结果说明,PDCD4核心启动子区位于-164～-67段。对该区域进行DNA序列分析发现,PDCD4核心启动子无TATA Box,具有较高的CG含量(>60%)并含有3个SP1结合位点。三、人PDCD4转录调控的初步研究1、结合PDCD4启动子区转录因子的分析及预测利用在线软件MatInspector分析PDCD4 5’端转录因子结合位点,发现PDCD4核心启动子区(-164～-67段)发现3个潜在的SP1结合位点(-151、-145、-72),此外PDCD4核心启动子两侧存在若干个重要的转录因子结合位点,以下为部分分析参数高于0.90并且参与肿瘤发生发展的TFBSs:NF-kB(-445)、RREB(-153)、IRFF(+66)、RREB(+239)、RREB(+283)、RREB(+293)。转录因子SP1通常负责维持PDCD4的基础水平转录,NF-kB是在肿瘤发生中起重要作用的转录因子,而Ras反应元件结合蛋白(ras-responsive element binding protein, RREB)是在Ras通路活化后上调并且可以调控基因转录的转录因子。2、SP1对PDCD4转录活性的影响转录因子SP1通常负责维持PDCD4的基础水平转录,我们在PDCD4核心启动子区发现了3个SP1结合位点(-151、-145、-72),结合前期截短实验结果,我们发现,PDCD4-P5(-164～+1)具有较强的启动子活性,随着PDCD4 5’端的截短,去除了两个Sp1结合位点(-151、-145)的P6(-114～+1)启动子活性开始下降,约为空载体的13倍,当截短到-67位点使3个Spl结合位点均缺失后,P7(-67～+1)启动活性完全丧失。提示3个SP1有可能共同负责维持PDCD4的基础水平转录。3、NF-kB对PDCD4转录活性的影响为了研究NF-kB对PDCD4转录活性的影响,我们通过对PDCD4启动子的截短而去除NF-kB结合位点,双荧光素酶检测其对PDCD4启动活性的影响。将PGL4-PDCD4-P1、P2分别与pRL-TK共转染转染OVCAR3细胞系后,pGL4-PDCD4-P1 M1/M2比值为pGL4-Basic空载体的54倍,而pGL4-PDCD4-P2M1／M2比值为pGL4-Basic空载体的45倍,结果说明,去除NF-kB结合位点后,PDCD4转录活性稍有下降,NF-kB有可能可以促进PDCD4的转录,该部分结果需要进一步的研究。4、成功构建PDCD4启动子3’端系列截短载体以及定点突变报告载体为了研究PDCD4转录调控机制,设计特异性引物对软件预测的PDCD4转录因子密集的区域进行截短,构建重组报告质粒。酶切、测序结果均证实重组截短载体pGL4-PDCD4-P8 (-548-+223)、pGL4-PDCD4-P9 (-315-+223)、pGL4-PDCD4-P 10(-315～+292)和定点突变载体pGL4-PDCD4-P1-RREB3mut构建成功。5、重组质粒双荧光素酶活性检测以及PDCD4转录负调控区的发现pGL4-PDCD4-P8(-548-+223)和pGL4-PDCD4-P9(－315～+223)双荧光素酶检测结果显示,在转染OVCAR3细胞系后,pGL4-PDCD4-P8、pGL4-PDCD4-P9、pGL4-PDCD4-P1、pGL4-PDCD4-P2 M1/M2比值分别为pGL4-Basic空载体的230、200、54和45倍。结果说明,缺失了+223-+350段的pGL4-PDCD4-P8和pGL4-PDCD4-P9相比pGL4-PDCD4-P1和P2,双荧光素酶活性均明显升高(约5倍),由于+10～+350段单独不具备启动活性,因此该检测结果说明,PDCD4转录起始位点下游的+223～+350区域是一个转录负调控区,该区域缺失后可以导致PDCD4启动子启动活性明显升高。6、PDCD4转录负调控区的进一步确定以及RREB对PDCD4负调控作用的初步研究为了研究转录因子RREB对PDCD4转录活性的影响,对PDCD4启动子3’端进行RREB结合位点的截短以及突变。截短载体pGL4-PDCD4-P10 (-315～+292)双荧光素酶检测结果显示,在转染OVCAR3细胞系后,pGL4-PDCD4-P10 (-315～+292)和pGL4-PDCD4-P2 (-315～+350)M1／M2比值均约为40倍,而pGL4-PDCD4-P9 (-315～+223)为200倍。结果说明,截短+296～+301区的RREB结合位点后对PDCD4转录活性没有明显影响,PDCD4转录负调控区位于+223～+292段,+292～+350段不含转录调控区。定点突变载体pGL4-PDCD4-P1-RREB3mut双荧光素酶检测结果同样显示,位于+292～+350段潜在的转录负调控因子RREB结合位点定点突变后,对PDCD4转录活性没有明显影响,也说明了+292～+350段不具备转录调控作用,最终确定PDCD4转录起始位点下游转录负调控区定位于+223～+292段。软件分析结果显示,+223～+292段还具有两个潜在的RREB结合位点,该转录因子可能对PDCD4转录活性起到一定调控作用。结论及意义1.本实验成功构建了一系列含人PDCD4启动子的萤火虫荧光素酶报告质粒,首次明确了人PDCD4核心启动子区。2.在PDCD4转录起始位点下游+223～+292段意外的发现一个转录负调控区,并对该区的转录因子做了初步研究,提示RREB有可能参与PDCD4的转录调控,为下一步研究PDCD4表达调控提供了基础