动脉粥样硬化(atherosclerosis，As)是危害人类健康的主要疾病，大量研究证实高胆固醇血症特别是高低密度脂蛋白胆固醇(lowdensitylipoproteincholesterol，LDLC)血症是动脉粥样硬化的主要危险因素，其病理过程主要与动脉壁脂质沉着有关。近年研究表明，动脉粥样硬化是脂质代谢异常、血液凝集因子、细胞因子、血流动力学负荷、遗传、行为性危险因素以及可能的感染等多种因素相互作用的结果。其基本病理损害是一系列特异性的细胞及分子的慢性炎症反应。动脉粥样硬化的早期病理损害，即所谓的“脂质条纹”，主要由单核细胞源性巨噬细胞和T淋巴细胞组成，是一种典型的炎症病变，以后在多种因素的作用下，病变部位的免疫反应细胞(巨噬细胞及淋巴细胞)进一步增加和激活，并伴有脂质聚集、血管内膜细胞增生及细胞外基质的沉着。研究观察到，在炎症性粥样斑块内存在大量激活的CD4+T淋巴细胞和巨噬细胞。最近研究表明免疫炎症反应在AS的发生，发展过程中起着重要的作用，大量研究表明，CD40配体(CD40L)参与了AS的炎症反应.CD40L分子参与免疫反应调节，即抗原呈递和自身免疫反应，与T细胞和巨噬细胞激活有关。CD40配体，即CD154，一种与TNF家族同源的膜蛋白。CD40配体具有免疫细胞信号传递的功能，经过CD40的信号，T细胞激活B细胞使B细胞增殖、分化成熟并且分泌抗体。近年的研究发现，CD40L的作用不只局限于炎症细胞之间信号传递，还参与动脉粥样斑块内主要细胞成分(包括血管内皮细胞、血管平滑肌细胞、巨噬细胞等)的炎症反应调节。大量的报道证实，CD40L与动脉粥样硬化的发生、发展密切相关，成为动脉粥样硬化发生的中心环节[1-5]。人的CD40LmRNA长为1803bp，人CD40L以两种形式存在，即可溶性和跨膜型，且两者都具有生物学活性[6]。CD40L与它的受体CD40结合，通过胞内信号因传递系统，参与AS发生，发展过程，激活血管内皮细胞释放炎症细胞因子和基质降解酶.临床研究表明，病人血液中可溶性CD40L含量与冠心病呈正相关[7]。因此，CD40L有望成为抗动脉粥样硬化时药物设计的新靶点[8]。基于以上分析，我们进行了人CD40LcDNA的克隆，重组表达质粒的构建，重组蛋白的原核表达、目的蛋白的纯化及生物学活性的初步鉴定，旨在深入阐明CD40L在AS中的作用机制及进一步研究和开发新型抗治动脉粥样硬化治疗候选制剂奠定基础。 目的：克隆编码人可溶性CD40L氨基酸的cDNA，将其构建于原核表达载体后，利用大肠杆菌诱导表达，并对表达的目的蛋白进行纯化，最终获得具有生物学活性的重组目的蛋白。 材料与方法： 1.克隆编码人可溶性CD40L氨基酸的cDNA。 2.重组表达质粒的构建。酶切pUC19/sCD40L质粒，将回收的目的片段sCD40L蛋白连接于原核表达载体pET-28a(+)。 3.目的蛋白的表达与鉴定。将构建的重组表达质粒pET-28a(+)/sCD40L转化大肠杆菌BL21，根据优化确定的IPTG诱导浓度、诱导温度和时间进行诱导表达，并行SDS-PAGE(5％积层胶，15％分离胶)检测目的蛋白的表达情况。再经蛋白质免疫印迹(WesternBlotting)鉴定目的蛋白的表达。 4.目的蛋白的分离纯化。收集经IPTG诱导后的细菌，鉴定目的蛋白的表达方式。将超声碎菌离心后的上清过Ni2+-NTA柱纯化目的蛋白，纯化后的目的蛋白再过多粘菌素B柱以消除目的蛋白中的LPS对实验的影响。 5.体外生物学活性的初步鉴定。利用MTT法检测重组蛋白刺激人外周血淋巴细胞和Raji细胞的增殖情况。 结果： 1.经RT-PCR成功地克隆了编码人可溶性CD40L氨基酸的cDNA，片段长为648bp经序列比对，与GenBank中报道的已知序列完全一致。 2.重组表达质粒pET-28a(+)/sCD40L经双酶切后，可见大小约为648bp的片段。酶切结果表明表达质粒构建成功。 3.经对诱导表达条件的优化和筛选，确定了最佳诱导表达条件为终浓度1mmol/L的IPTG，在37℃诱导表达4h。SDS-PAGE分析可见，表达的目的蛋白的大小约为30kDa。其中目的蛋白的表达量经软件分析，达到了细菌表达蛋白总量的约40％，主要是以分泌形式表达。经WesternBlotting证实，在大小约为30kDa的位置有清楚的蛋白条带。 4.目的蛋白经Ni2+-NTA柱纯化后，再经多粘菌素B柱有效地去除了LPS，纯化的蛋白在SDS-PAGE上呈现单一条带，证明目的蛋白得到有效的纯化。 5.生物学活性的初步分析显示，所制备的目的蛋白sCD40L可有效地刺激人外周血淋巴细胞和Raji细胞的增殖。 结论： 本实验利用RT-PCR技术，成功地自人扁桃体组织克隆了编码人sCD40L氨基酸的cDNA，并成功地构建了重组原核表达质粒pET-28a(+)/sCD40L。将上述质粒转化大肠杆菌BL21，经IPTG诱导均高水平地表达了目的蛋白，大小约为30kDa。经分离纯化后的目的蛋白表现出相应的生物学活性，从而证明了我们成功地利用原核表达系统高效表达了具有生物学活性的重组目的蛋白。为进一步研究CD40L的作用机制及寻找新型CD40L拮抗剂奠定了基础。