现已认识到恶性肿瘤的发生、发展与肿瘤细胞增殖与凋亡失调显著相关,受多种相关基因的调控,其中Livin/ML-IAP/KIAP(以下称Livin)是IAPs(Inhibitor of Apoptosis Proteins)家族成员之一,Livin基因编码两种亚型,分别称为Livin-α和Livin-β。Livin是近来发现的恶性肿瘤相关的凋亡抑制蛋白(IAPs)家族成员之一,多数情况下,Livin仅在肿瘤细胞中表达而在相应组织中不表达或低表达,同时Livin的两个亚型在不同组织甚至在相同组织来源的不同细胞系中表达也有显著差别。Livin在前列腺癌组织中高表达。我们在雄激素依赖性前列腺癌细胞系LNCaP中发现仅表达Livin-α,而在另一雄激素非依赖性前列腺癌细胞系PC3中Livin-α和Livin-β均高表达。因而Livin及其亚型可能在前列腺癌的发生和进展中发挥重要作用。由于Livin在肿瘤细胞的凋亡调节中的作用已得到大多数研究人员的认同。目前认为Livin抗凋亡作用主要是间接通过XIAP抑制Caspases途径,使Caspases3、7、9的活性受到抑制导致凋亡受阻。另外,有研究发现Livin与SMAC的高亲和力作用将会有力的与XIAP-SMAC的相互作用进行竞争,牢固结合SMAC来抑制凋亡,阻止SMAC对由XIAP介导的Caspases凋亡抑制作用。除此之外,Livin还可通过TAK1/TAB1信号级联反应通路激活JNK1,而激活的JNK1是对于介导对抗TNF-α和白细胞介素转化酶的凋亡保护所必需。虽然Livin-α和β结构上极为相似,但二者的功能并不相同。尽管Livin-α和β都能保护细胞免受肿瘤坏死因子α(TNF-α)和抗CD95诱导的凋亡,但阻断Livin-β而不是阻断Livin-α可以抑制HeLa细胞克隆形成的同时使细胞对不同促凋亡诱导物如紫外线辐射、TNF-α或依托泊苷化疗敏感性增加。Livin作为结构上与Survivin最接近的IAP可以调控黑色素瘤细胞LiBr的细胞周期。在Hela细胞中Livin主要位于细胞核,在胞浆中以丝状蛋白的形式存在,与Survivin在Hela细胞中的分布一致,为Livin调节细胞周期也提供了有利的证据。我们分别在前列腺癌细胞系LNCaP和PC3的研究发现Livin-α可促进通过细胞周期G1/S调控点,Livin-β明显抑制凋亡。MicroRNA(miRNA)是一种内源性非编码单链RNA分子,是一类在转录后水平调控基因表达的非编码蛋白质的小RNA。据估计至少有30%以上的人类基因受到miRNA的调控。我们在研究前列腺癌细胞中Livin的转录后抑制现象与miRNA抑制有关。我们认为肿瘤细胞存在增殖和凋亡失调部分原因是由于Livin表达所导致。但现有文献Livin受miRNA调控的报导。这些Livin亚型在细胞增殖、凋亡以及(?)miRNA调控Livin的研究为前列腺癌的发生、进展机制的研究提供了新的研究方向和重要依据。目的：本文旨在前列腺癌细胞中探讨Livin基因与前列腺癌增殖、凋亡之间的联系以及miRNA调控Livin的机制,为深入研究Livin相关miRNA搭建研究平台,为前列腺癌的靶向治疗提供实验依据。材料和方法：1.我们在LNCaP和PC3两个人前列腺癌细胞系中进行Livin亚型的表达谱分析,同时在此基础上在体外进一步将LNCaP作为细胞模型,使用Livin特异性RNAi及过表达技术,于转染前后分别进行细胞周期分析、增殖指数和MTT细胞存活率检测,研究Livin对LNCaP细胞的细胞周期、增殖指数和细胞周期蛋白Cyclins的影响。2.使用Western blot在LNCaP和PC3两个人前列腺癌细胞系中进行Livin亚型的表达谱分析,同时在此基础上在体外进一步将PC3作为模型,使用Livin特异性RNAi技术,分别进行Livin-a与β的RNAi,随后进行Annexin V凋亡检测和MTT细胞存活率检测,观察Livin基因对前列腺癌凋亡的影响以及对凋亡诱导剂的敏感性改变。3.对多个前列腺癌细胞系的Livin表达进行RealTime RT-PCR、Western blot检测；构建Livin基因mRNA的3’UTR区的双荧光素酶报告基因表达载体,通过计算机MiRNA软件预测、筛选并利用体外双荧光素酶报告基因检测系统实验验证特异性抑制Livin的miRNA。结果：1. Livin亚型在前列腺癌细胞中调控细胞增殖的研究我们发现Livin-α在雄激素依赖性前列腺癌细胞系LNCaP和雄激素非依赖性前列腺癌细胞系PC3两种细胞系中均有表达,而Livin-β则仅在PC3细胞中表达。特异性Livin-αsiRNA下调LNCaP细胞中的Livin-α蛋白后不仅导致LNCaP细胞G0/G1期细胞比例增加,相应的S期细胞比例减少,即G1/S细胞周期阻滞；而过表达Livin-α可使LNCaP细胞G0/G1期细胞减少,同时S期细胞增多,即促进细胞通过G1/S细胞周期调控点。同时Livin-α表达强弱与增殖指数高低呈正相关。结果提示,Livin-α诱导LNCaP细胞进入增殖状态并提高增殖指数。同时进行的MTT细胞生存率检测结果显示下调或上调Livin-α可以相应地降低或升高LNCaP的生存率。Livin-α过表达的LNCaP细胞显示了Cyclin D1尤其是Cyclin E升高,而Cyclin A无明显变化。虽然过表达Livin-β可提高LNCaP细胞生存率,但是细胞周期及增殖指数的改变均无统计学意义。2. Livin对人前列腺癌细胞凋亡调节作用的研究我们发现Livin-α和Livin-β在PC3细胞系中均高表达。在PC3细胞中进行的Livin-α与β的RNAi后进行Annexin V-FITC检测,结果发现虽然下调Livin-α和Livin-β均可提高PC3细胞生存率,但是与阴性对照组相比,下调Livin-β明显导致PC3细胞凋亡显著增加,并提高PC3细胞对肿瘤坏死因子TNF-α和凋亡诱导剂依托泊苷的凋亡敏感性增加。下调Livin-α提高PC3细胞对肿瘤坏死因子TNF-α和凋亡诱导剂星孢霉素的凋亡敏感性增加,虽然下调Livin-α也导致PC3细胞凋亡增加,但与对照组相比无显著性差异。3. microRNA对前列腺癌中Livin基因表达调控的研究通过Real TimeRT-PCR、Western blot检测发现LNCaP、DU145前列腺癌细胞中Livin基因表达存在转录后抑制现象；通过转染反义特异性MiRNA发现这种Livin基因的转录后抑制现象是由特异性抑制Livin mRNA的miRNA所导致；通过基因克隆的方法成功构建Livin基因mRNA的3’UTR区的双荧光素酶报告基因表达载体；通过计算机MiRNA软件预测、筛选几条Livin mRNA的候选MiRNA:通过Western blot检测和体外双荧光素酶报告基因验证了miR-198是一条对Livin基因3’UTR靶位点产生特异性抑制的MiRNA.结论：1. Livin-α通过调节G1-S细胞周期调控点促进前列腺癌细胞增殖,在前列腺癌的发生中而扮演重要角色；Livin-β虽然促进前列腺癌细胞生存率提高,但该作用不是通过影响细胞周期所导致。2. Livin-β通过抑制凋亡促进前列腺癌细胞生存率提高,提高PC3细胞对肿瘤坏死因子TNF-α和凋亡诱导剂依托泊苷的凋亡敏感性增加,在前列腺癌中而扮演重要角色；Livin-α提高PC3细胞对肿瘤坏死因子TNF-α和凋亡诱导剂星孢霉素的凋亡敏感性增加,虽然Livin-α虽提高前列腺癌生存率,但该作用主要不是通过影响细胞凋亡所致。3. LNCaP、DU145前列腺癌细胞中存在的Livin基因表达存在转录后抑制现象是由特异性抑制Livin mRNA的miRNA所导致。成功构建Livin基因mRNA的3’UTR区的双荧光素酶报告基因表达载体并成功预测、筛选并验证了特异性抑制Livin的MiRNA。