目的：　　 获得性免疫缺陷综合征(acquired immune deficiency syndrome,AIDS)是由人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)感染引起的一种严重传染病。HIV主要侵犯免疫系统的CD4+T淋巴细胞,造成机体免疫功能下降,最终因患各种机会性感染或肿瘤而死亡。HIV新发急性感染是指HIV病毒进入人体的最初6个月,是宿主免疫系统与病毒之间相互斗争的关键阶段,在免疫系统发挥杀伤作用后病毒从高水平下降到一个稳定水平,即病毒调定点,研究显示病毒载量调定点越高,进入AIDS期越快,病人存活时间越短,病毒与机体免疫相互作用影响和决定着HIV感染者的疾病结局。研究HIV新发急性感染者细胞免疫应答的变化对于明确HIV感染的免疫致病机制、判断疾病进展及预后有着重要的作用。天然免疫是人体对抗HIV感染的第一道防线。CD123+类浆细胞样树突状细胞(plasmacytoid dendritic cells,pDC)作为天然免疫中的重要效应细胞可能在HIV新发急性感染中起着重要作用。　　 pDC是树突状细胞(dendritic cells,DC)的一个重要亚群,连接天然免疫反应和适应性免疫反应,在病毒刺激下能够产生大量的IFN-α,发挥直接的抗病毒活性[8],并且能通过激活NK、NKT等天然免疫细胞发挥天然免疫反应。此外,pDC在一定程度上能提呈抗原给T细胞,刺激T细胞活化,发挥适应性免疫反应。有体外研究显示,HIV感染后,pDC产生大量的IFN-α,并且上调共刺激分子CD80/CD86和成熟标志CD83的表达,并且pDC主要通过Foll样受体(toll-likereceptor,TLR)7和9对HIV RNA进行识别。TLR7和TLR9表达于pDC的酸性内含体(endosome),TLR7主要识别病毒ssRNA,TLR9主要识别病毒CpG-ODN片段进行信号传导,最终通过激活NF-κB,影响pDC功能的发挥。pDC的功能主要是产生大量的IFN-α,因此研究IFN-α的变化情况对于pDC功能的判定起着重要作用。　　 HIV感染能引起外周血pDC数量和功能的变化。目前对HIV慢性感染者研究较多,国外和本实验室的前期研究结果均显示,HIV慢性感染者pDC数量减少,并与疾病进展阶段有关,共刺激分子CD80/CD86和成熟标志CD83表达上调,但是对于IFN-α分泌的研究结果却存在争议,有研究报道HIV感染者IFN-α的产生增加并且与病毒载量和疾病进展无关,也有研究报道IFN-α的产生减少并与机会性感染和疾病进展有关。而国际上对HIV新发急性感染者的研究较少,且多集中于数量的研究,大量研究结果显示,HIV新发急性感染者pDC数量明显下降,并且研究显示pDC数量与病毒载量呈显著负相关,但是pDC数量与病毒调定点的关系尚未见报导。此外HIV新发急性感染者pDC共刺激分子CD80/CD86和成熟标志CD83的表达国内外尚未见报道。关于HIV新发急性感染者pDC产生IFN-α的情况国内外鲜见报导,尤其是尤其是HIV感染者TLR7和TLR9表达,信号传导通路及其与IFN-α分泌之间的关系国内外尚未见报导。　　 中国人群的遗传特征和HIV流行毒株也与欧美人群不同,因此对中国人群pDC数量和功能进行研究非常重要。而且HIV新发急性感染病例很难得到,国内外对HIV新发急性感染者pDC的变化情况鲜见报道。本课题拟对HIV新发急性感染者pDC的数量、活化和成熟状态、细胞因子IFN-α分泌进行系统研究,对TLR7、9表达及其信号传导通路活化进行研究,明确HIV新发急性感染者pDC数量与功能的变化及其。TLR7、9信号传导机制,明确pDC数量和功能与病毒调定点之间的关系,揭示pDC在HIV疾病进展中的作用,为HIV的免疫治疗提供新的思路。　　 方法：　　 1、研究对象　　 HIV感染的男男性接触者83例,按感染时间不同分为HIV新发急性感染者(primary HIV infection,PHI)和HIV慢性感染者(chronic HIV infection,CHI)。HIV新发急性感染者37例,年龄平均32(23-45)岁。入选标准(满足下列一项或多项者即可纳入):①在6个月内HIV抗体开始变阳性;②HIV抗体阴性但HIV RNA阳性;③HIV抗体弱阳性但在2周内可以重复并OD值较前次升高;④有早期HIV感染的临床症状、HIV抗原阳性及WB抗体检测少于4条蛋白带。HIV慢性感染者46例,平均年龄37(25-59)岁。入选标准:未接受抗逆转录病毒治疗,感染时间一年以上。健康对照组15例,平均年龄30(24-45)岁,入选标准:血常规及肝功正常、乙型肝炎表面抗原及抗丙型肝炎抗体阴性,无免疫系统疾病。　　 2、CD4+T细胞绝对值的检测　　 将20μl BD公司CD4 FITC/CD8 PE/CD3 PerCP试剂加入绝对计数管中,逆向加样法加入50μl混匀的抗凝全血,室温避光15min,加入1×免洗溶血素450μl,室温避光15min,应用FACS Calibur流式细胞仪进行检测,MultiSET软件分析结果,得到CD4+T淋巴细胞的绝对值。　　 3、pDC细胞绝对计数　　 将15ul lineagel-FITC、6ulCD123-PE、6ulHLA-DR-PerCp依次加入绝对计数管中,再加入100ul抗凝全血,室温避光15分钟,加入BD公司免沈溶血素450ul,室温避光15分钟,用流式细胞仪CELLQUEST软件检测并进行分析,获得pDC细胞绝对值。　　 4、pDC表面标志CD86、CD83的检测　　 复苏2×106 PBMC(外周血单个核细胞),并平均分配至2个流式细胞管中。做好标记,并分别加入相应的荧光抗体组合,混匀,4℃冰箱避光孵育30分钟。孵育结束后,每管加入3ml鞘液重悬,离心,弃上清。混匀后加入含1％多聚甲醛的固定液200μl重悬,应用FACSAria流式细胞仪进行检测,BD FACSDivaTM软件分析结果。　　 5、pDC IFN-α的分泌及相关传导通路的检测　　 取一块12孔板,将将复苏好的6×106 PBMC分别放入两个孔中,其中一孔加终浓度为5μg/ml的R848,另一孔加终浓度为5μg/ml的CpGODN2216,充分混匀后,将12孔板放入37℃、5％CO2培养箱中培养,12小时后两孔中分别加入Golgi Plug,辊匀,继续培养10小时。孵育结束后取6支流式管,各管中均加入单克隆荧光抗体组合Lin-PerCP/CY5.5/HLA-DR-APC-CY7/CD123-PE-CY7,将细胞加入到相应各管中,混匀,4℃冰箱避光孵育30分钟。表面染色后,加入Cytofix/Cytoperm solution4℃冰箱中破膜20分钟。破膜结束后,洗涤,各管加入胞内染料组合后充分混匀,4℃冰箱避光孵育30分钟。洗涤,多聚甲醛固定后应用LSRⅡ流式细胞仪进行检测,BD FACSDivTM软件分析结果。　　 6、HIV病毒载量测定　　 以200μl血浆采用标准版模板制备法提取RNA,采用Roche公司HIV-1Monitor1.5试剂盒在COBAS AMPLICOR自动载量仪上以RT-PCR方法测定病毒载量。　　 7、统计学分析　　 应用SPSS11.5软件包进行统计分析,所有数据以中位数表示,两组间实验指标的比较采用Mann-Whitney U检验,相关性分析采用Spearman秩相关检验,P＜0.05为有统计学意义。　　 结果：　　 一、pDC数量的变化研究:　　 1、HIV新发急性感染者外周血pDC绝对值与慢性感染者及健康对照的比较:　　 HIV新发急性感染者pDC平均值为7.46±2.86个/μl,显著低于健康对照组(11.22±4.22个/μl,P＜0.001),但与HIV慢性感染者(8.06±3.18个/μl)相比无显著性差异。　　 2、HIV感染者pDC数量与病毒载量及CD4+T细胞数量的关系:　　 HIV新发急性感染者pDC绝对值与病毒载量水平显著负相关(r=-0.418,p=0.034),与CD4+T淋巴细胞数量无相关性(r=0.369,p=0.07)。HIV慢性感染者pDC绝对值与病毒载量显著负相关(r=0.501,p=0.019),与CD4+T淋巴细胞数量显著正相关(r=0.462,p=0.009)　　 3、pDC绝对值与病毒调定点的关系:　　 根据病毒调定点的高低将26例HIV新发急性感染者分为两组,其中14例病毒调定点＞104copies/ml为高病毒调定点组,12例病毒调定点＜104copies/ml为低病毒调定点组。高病毒调定点组的14例HIV新发急性感染者pDC平均值为5.76(2.36-11.46)个/μl,显著低于低病毒调定点组的12例HIV新发急性感染者9.30(4.79-13.13)个/μl(P＜0.05)。　　 二、pDC表面标志的变化研究:　　 1、HIV新发急性感染者pDC表面表达标志与健康对照和慢性感染者的比较:　　 HIV新发急性感染者和HIV慢性感染者pDC表达CD83和CD86的百分比显著高于健康对照组(P=0.001,P=0.032)。　　 2、HIV感染者pDC表面标志与病毒载量及CD4+T细胞的关系:　　 HIV新发急性感染者pDC表面CD86的表达与病毒载量显著正相关(P=0.024),与CD4+T细胞没有显著相关关系(P=0.199)(图8)。HIV慢性感染者pDC表面CD86的表达与病毒载量显著正相关,与CD4+T细胞显著负相关(P=0.019,P=0.026)　　 三、pDC功能的变化研究:　　 1、在TLR7、TLR9的激动剂R848、CpG-ODN的刺激作用下pDC产生IFN-α能力的变化情况:　　 在TLR7激动剂R848刺激作用下,HIV新发急性感染组pDC产生的IFN-α高于健康对照组和慢性感染组(P=0.01,P=0.002)。在TLR9激动剂CpG-ODN的刺激作用下,HIV新发急性感染者pDC产生的IFN-α显著高于慢性感染组(P=0.018),而与健康对照组相比没有显著性差异(P=0.348)　　 2、IFN-α的产生与CD4+T细胞和病毒载量的相关关系:　　 在TLR9激动剂CpG-ODN的刺激作用下,HIV新发急性感染者pDC产生的IFN-α与病毒载量显著负相关(r=0.736,p=0.01)　　 3、IFN-α的产生与病毒调定点的关系:　　 根据病毒调定点的高低将11例HIV新发急性感染者分为两组,其中5例病毒调定点＞105copies/ml为高病毒调定点组,5例病毒调定点＜103copies/ml为低病毒调定点组。在CpG-ODN刺激作用下高病毒调定点组的5例HIV新发急性感染者pDC所产生的IFN-α MFI显著低于低病毒调定点组的(P=0.047)　　 4、TLR7和TLR9的表达及TLR7传导通路中NF-κ B的变化情况:　　 TLR7在HIV新发急性感染组中的表达显著高于健康对照组(P=0.049),而与HIV慢性感染者相比没有显著性差异。TLR9在HIV新发急性感染组中的表达显著高于慢性感染组(P=0.037),而与健康对照组相比没有显著性差异(P=0.282)。NF-κ B在HIV新发急性感染者pDC中的表达显著高于健康对照组(P=0.024),而与慢性感染者相比没有显著性差异(P=0.287)。　　 结论：　　 1、HIV新发急性感染者外周血pDC绝对值显著降低,pDC的成熟标志CD83和活化标志CD86的表达显著增高,提示HIV感染早期pDC数量减少,且处于高活化状态,产生的IFN-α增高。提示HIV感染早期pDC数量下降,但功能增强。　　 2、首次研究HIV新发急性感染者pDC内TLR7和TLR9传导通路的变化,发现HIV新发急性感染者pDC的TLR7-NF-κ B-IFN-α传导通路中TLR7和NF-κ B表达以及IFN-α分泌水平显著高于健康对照,TLR7表达与IFN-α分泌水平显著正相关;TLR9-NF-κ B-IFN-α传导通路中TLR9表达和IFN-α分泌水平显著高于HIV慢性感染者,与健康对照无显著性差异。　　 3、HIV新发急性感染者低病毒调定点组pDC绝对值较高,产生的IFN-α也显著高于高病毒调定点组,与病毒载量显著负相关,提示IFN-α的增加能够抑制病毒复制,从而延缓疾病进展速度。