鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)是人和动物肠道中正常菌群之一,是一种重要的益生菌,肠道黏着率高,定植能力强,可构成肠道生物屏障,提高机体非特异性免疫力,促进肠道稳态平衡,进而增强机体抵抗肠道致病菌感染的能力。然而,目前对鼠李糖乳杆菌调节肠道稳态抵抗致病菌感染的作用机制尚未完全清楚,同时鼠李糖乳杆菌与宿主互作调节机体免疫机制的研究也相对滞后。因此,为进一步认知鼠李糖乳杆菌的益生菌特性以更好地服务于生产实践,本研究以鼠李糖乳杆菌肠道分离株CIQ249为模式菌,从物理屏障和免疫屏障角度,探究鼠李糖乳杆菌调节肠道稳态抵抗肠道致病菌的潜在作用机制。第一部分,测定了CIQ249菌株的一步生长曲线与产酸能力、肠道定植能力、消化环境耐受能力及促进动物生长性能。具体内容及结果如下:首先采用革兰氏染色、生化鉴定以及16S r RNA基因测序比对,对保存的鼠李糖乳杆菌分离株CIQ249进行了确认,并进一步测定了该菌的一步生长曲线及相对应的产酸水平,实验结果显示,菌体以1:100比例转接培养后4 h开始进入对数生长期,14 h达生长平台期,同时产酸能力也随菌体增殖而增强,两者呈正相关关系,p H值降至3.0左右趋于稳定;以BALB/c小鼠为动物模型,采用CFDA-SE荧光探针标记评价了CIQ249菌株的肠道定植能力,结果显示,灌服CFDA-SE标记菌后第1 d在小鼠空肠、回肠和结肠部的标记菌检出比分别为75.03%、86.43%和86.52%,随后逐渐下降,第7 d时在空肠、回肠和结肠部标记菌检出比平均在50%左右,灌服后第15 d检出比仍在20%以上,表明该菌株具有良好的肠道定植能力;评价了CIQ249菌株耐受消化环境的能力,结果显示,该菌对p H1.5的胃液、0.3%胆汁酸盐、9%氯化钠(高渗环境)等极端消化环境具有一定的耐受能力,同时在模拟肠液环境中出现生长趋势;此外,口服CIQ249菌株能够提高动物的日均采食量与日均增重。第二部分,评价了CIQ249菌株代谢产物的抑菌作用、保护动物抗肠道致病菌感染的能力以及对感染动物生长性能的影响。具体内容及结果如下:采用抑菌圈法检测了CIQ249菌株代谢产物的体外抑菌效果,结果显示,菌体培养离心后的上清(未调/调p H至7.0)对大肠杆菌K99、大肠杆菌O78、大肠杆菌O157、肠致病性大肠杆菌、溶血链球菌、粘质沙雷菌、小肠结肠炎耶尔森菌、金黄色葡萄球菌、志贺氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、费氏柠檬酸杆菌、溶藻弧菌、单核细胞增生李斯特氏菌、霍乱弧菌、拟态弧菌和副溶血性弧菌等致病菌均表现出一定的抑制效果,同时扫描电镜观察显示致病菌体出现明显的皱缩,上述结果表明CIQ249菌株的代谢产物具有抑菌作用,但对植物乳杆菌、德式乳杆菌、屎肠球菌和罗伊氏乳杆菌未见抑制作用;将CIQ249菌株灌胃小鼠和雏鸡,然后分别用绝对致死量的鼠伤寒沙门氏菌和大肠杆菌K99口服感染小鼠以及用鼠伤寒沙门氏菌和大肠杆菌O78口服感染雏鸡,同时设CIQ249组、致病菌组、CIQ249与致病菌混合组以及正常动物对照组,结果显示,口服CIQ249菌株能够为动物提供一定的抗肠道致病菌感染保护作用,其保护率可达60%,CIQ249菌株与致病菌混合组的动物存活率在50%以上,而感染致病菌组动物全部死亡;实验动物肠道病理学观察结果显示,肠道致病菌感染可导致动物肠道黏膜发生严重病理损伤,而口服CIQ249菌株可有效减轻肠道黏膜损伤,促进肠绒毛生长,增加绒毛长度与隐窝深度比值,降低被感染动物临床症状评分以及改善被致病菌感染动物的生长性能。第三部分,评价了CIQ249菌株对细胞间紧密连接蛋白表达的影响、促进免疫相关细胞因子分泌作用以及调节黏膜抗体Ig A分泌作用。具体内容及结果如下:采用间接免疫荧光、q PCR和Western blot方法检测了CIQ249菌株体外和体内对细胞间紧密连接蛋白Zo-1和Claudin-1表达的影响,结果显示,CIQ249菌株体外作用猪肠道上皮细胞(PIEC)以及饲喂小鼠和雏鸡后能够显著促进细胞间紧密连接蛋白Zo-1和Claudin-1基因的m RNA转录与蛋白表达,感染致病菌组Zo-1和Claudin-1基因的m RNA转录水平与蛋白水平呈现下调,而实验动物在饲喂CIQ249菌株后再行感染致病菌Zo-1和Claudin-1的水平未见下调,表明鼠李糖乳杆菌可通过增强细胞间的紧密连接以抵抗致病菌的感染;采用ELISA试剂盒检测了饲喂CIQ249菌株小鼠血清和肠黏液中细胞因子IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-17、IL-27水平,与空白对照组相比,上述细胞因子水平均呈现显著上升趋势;采用ELISA试剂盒检测饲喂CIQ249菌株小鼠肠黏液以及血清中Ig A抗体水平,结果显示,饲喂CIQ249菌株可显著促进机体非特异性Ig A抗体的分泌;初步探究了鼠李糖乳杆菌调节Ig A产生的机制,结果显示,鼠李糖乳杆菌可激活肠道树突状细胞,促进Peyer’s集合淋巴结CD4+T细胞中Bcl-6的表达,进而诱导CD4+T细胞向CXCR5+CD4+Thf细胞分化,同时B细胞在Thf细胞介导下逐渐分化成熟为B220-Ig A+浆母细胞。第四部分,为进一步解析鼠李糖乳杆菌调节机体免疫抑制肠道致病菌感染的机制,本研究利用RNA-seq技术,以正常小鼠作为对照组(C组),对口服CIQ249小鼠(CL组)、感染鼠伤寒沙门氏菌小鼠(CP组)、口服CIQ249+感染鼠伤寒沙门氏菌小鼠(CLP组)的肠道转录组进行了测序分析,与C组相比,CL组获得728个差异表达基因(上调表达251个和下调表达477个),CP组获得149个差异表达基因(上调表达38个和下调表达111个),与CP组相比,CLP组获得5326个差异表达基因(上调表达4019个和下调表达1307个)。其中,CL组显著差异表达基因主要富集于调节细胞生长、凋亡、抗炎等信号通路,如p53信号通路、MAPK信号通路、NLRs信号通路等,而CP组显著差异表达基因主要富集于沙门氏菌感染(Salmonella infection)信号通路,当使用鼠李糖乳杆菌进行干预时,富集于此信号通路的显著差异表达基因数明显减少。此外,随机选取CP组vs.CLP组与宿主免疫相关的差异表达基因MX2、Rnasel、IL-6、Il-13ra2、Il-22ra1、Pla2g2a、Anpep、Rap1gap、Galnt6、IGF2、Rsl1d1、Cfh、Masp2、Bdkrb1进行RT-q PCR符合性验证,结果显示,RT-q PCR结果与RNA-seq测序结果的基因表达趋势一致,表明RNA-seq测序结果可靠。以上测序结果为进一步了解鼠李糖乳杆菌调节宿主免疫促进机体抗肠道致病菌感染的机制提供了基础数据资料。综上,本研究显示,鼠李糖乳杆菌具有良好的肠道定植能力、消化环境耐受能力、促进动物生长等益生性,能够有效调节肠道稳态(物理屏障和免疫屏障)以增强动物抵抗肠道致病菌感染的能力,研究结果为进一步开发鼠李糖乳杆菌微生态生物制剂提供了理论与数据支持。