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研究背景:
抑郁症(major depression)发病机制及治疗一直是精神疾病研究中的热点。随着新药不断开发研制,抗抑郁药物的种类和疗效都得到了快速发展,而抗抑郁药物的治疗确切机制尚未明了。当前抑郁症研究重点集中到抑郁症的病理机制和抗抑郁药物的长期作用机制。目前临床使用的大部分抗抑郁药(如单胺氧化酶抑制剂、选择性5-羟色胺再摄取抑制剂等)都是通过快速调节突触间隙的单胺类神经递质浓发挥疗效的,如五羟色胺(serotonin,5-HT)、去甲肾上腺素(Noradrenaline,NE)和多巴胺(Dopamine,DA)。然而,临床应用显示现有的各种抗抑郁药物只能在部分患者中能够发挥疗效(50%-70%),并且抗抑郁药物改善抑郁症状的起效时间较为缓慢,通常在2-4周,这种起效迟缓的现象不能完全用单胺类神经递质浓度快速改变现象来解释。
随着研究的不断深入,抗抑郁药物的机制研究已经由对抑郁症患者及应激抑郁动物模型脑内神经受体、神经递质的影响深入到对细胞内信号通路的激活水平的影响。其中ERK信号通路在抑郁症发病机制的作用越来越受到重视,之前研究证实多种应激刺激引发动物产生抑郁行为的同时还导致海马等脑区的ERK及下游转录因子CREB激活水平降低,而抗抑郁药物治疗,如氟西汀可改善强迫游泳应激所致的海马ERK及CREB激活水平降低。本文第一部分将观察慢性应激刺激及氟西汀对大鼠ERK及CREB活性影响,并进一步比较应激反应不同的动物间ERK及CREB活性差异。此外,研究表明ERK通路激活水平改变不仅直接与抑郁行为有关,还可影响一些抗抑郁药物的行为学效应。研究显示病毒介导基因转移技术使ERK表达降低可使小鼠产生类抑郁行为,而体内ERK表达上调小鼠对应激产生抵抗。本文第二部分研究将探讨ERK信号通路在氟西汀调控动物行为中的作用机制。
此外,许多动物研究证实多种慢性应激刺激导致大鼠海马神经发生受损,给予大鼠氟西汀注射2周则可逆转损伤的海马神经发生,并且研究表明氟西汀改善动物抑郁行为效应依赖于海马神经发生的存在。因此,探究氟西汀促进海马神经发生的分子信号机制对了解氟西汀疗效机制有重要意义。大量研究提示ERK信号通路是介导细胞反应的重要信号系统,激活后将多种细胞外刺激信号转入到细胞内,对细胞增殖、分化、凋亡过程有重要作用。本文第三部分研究将考察ERK信号通路在氟西汀调控大鼠海马神经发生中的作用机制。
目的:
本研究的目的是:探讨ERK信号通路在慢性应激大鼠模型海马及额叶部位激活情况,并考察ERK通路在盐酸氟西汀调节大鼠行为、海马神经发生中的作用机制:
(1)构建慢性应激大鼠模型(chronic mildstress,CMS),考察对慢性应激反应不同的大鼠海马及前额叶部位ERK及CREB在总蛋白表达水平及磷酸化水平影响,探讨ERK信号通路是否与大鼠应激反应差异有关。
(2)正常大鼠侧脑室注射u0126对ERK通路进行阻断,检测ERK信号通路在盐酸氟西汀调节大鼠海马自主行为的作用机制。
(3)正常大鼠侧脑室注射u0126对ERK通路进行阻断,检测ERK信号通路在盐酸氟西汀调控大鼠海马神经发生的作用机制。
方法:
1.成年雄性SD大鼠50只,体重200~250g,动物随机分为3组:2/86对照组12只(control goup);应激组26只(stress group);氟西汀组12只(fluoxetine group)。其中应激组与氟西汀组大鼠均经过8周慢性应激刺激,其中氟西汀组在第5周开始给予盐酸氟西汀(10mg/Kg,I.P.),直到8周末。正常对照组不给予任何刺激。在应激前一天、应激开始后每周进行一次糖水偏好测验。8周后行糖水偏好实验和旷场试验,根据8周末糖水偏好测验中糖水饮用比率将应激组大鼠又分为应激敏感组(sensitive group)、应激适应组(resilience group)。8周结束后将四组大鼠断头处死,采用蛋白免疫印记技术检测大鼠海马、额叶部位ERK、CREB、p-ERK、P-CREB水平。
2.正常SD大鼠分为三组:正常对照组+生理盐水组8只(control),氟西汀+抑制剂组11只(flu+U0126),氟西汀+溶剂组11只( flu+vehicle)。首先,依据分组向大鼠左侧脑室注射生理盐水、U0126(1nmol只/天)、vehicle;后两组每天给予皮下注射氟西汀(10mg/Kg),连续两周后大鼠进行旷场试验。vehicle配制方法(PBS:DMSO=4:1)
3.正常SD大鼠分为三组:正常对照组+生理盐水8只(control),氟西汀+抑制剂组11只( flu+U0126),氟西汀+溶剂组11只( flu+vehicle)。首先,依据分组向大鼠左侧脑室注射生理盐水、U0126(1nmol/L/每天)、vehicle;后两组给予每天皮下注射氟西汀(10mg/Kg),两周后给予腹腔注射Brdu(50mg/kg),2h后灌注取脑,进行神经发生免疫荧光检测。
结果:
1.①在8周末sensitive group糖水引用百分比低于应激适应组(resilience group)、正常对照组(control group)及氟西汀组(fluxetinegroup)(P<0.05)。
②sensitive group的跨格次数、中心格时间和直立次数明显低于fluxetine group和control group(p<0.05),与resiliencegroup无明显差异(p>0.05)。
③sensitive group海马及前额叶中P-CREB水平明显低于resilience group、fluxetine group及control group(P<0.05); fluxetine group海马部位P-CREB水平明显高于其它三组(P<0.05);resilience group与control group之间海马及前额叶P-CREB无明显差异(P>0.05);四组大鼠间海马部位、前额叶CREB总蛋白水平无明显变化。
④sensitive group海马及前额叶中P-ERK水平明显低于resilience group、fluxetine group及control group(P<0.05);fluxetine group海马部位P-ERK明显高于其它三组(P<0.05); resiliencegroup与control group之间P-ERK无明显差异(P>0.05)。四组大鼠间海马、额叶部位ERK总蛋白无明显变化。
2.flu+U0126组大鼠总自主活动距离、总跨格次数、第一分钟活动距离低于fu+vehicle组(p<0.05); flu+U0126、flu+vehicle、control三组之间在中央活动距离、外周活动距离两个指标中没有明显差异(P>0.05)。
3.①给予大鼠腹腔注射盐酸氟西汀14天后,flu+vehicle组海马部位p-ERK水平明显高于正常对照组(P<0.05);同时给予大鼠侧脑室注射U0126( flu+U0126组)(1nmol/只)后海马部位p-ERK明显低于flu+vehicle组(P<0.05)。
②flu+U0126组海马p-CREB明显低于flu+vehicle(p<0.05)。
③flu+U0126组、flu+vehicle组、正常对照组三组之间的齿状回海马神经水平发生无明显差异(p<0.05)。
结论:
1.ERK/CREB通路激活水平与慢性应激状态下大鼠的应激敏感性有关;ERK/CREB信号通路参与了盐酸氟西汀改善大鼠行为效应的作用机制。
2.ERK信号通路激活水平可能参与了氟西汀影响大鼠自主活动水平的作用机制。
3.ERK信号通路激活水平对氟西汀调控海马神经发生无明显影响。