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激活素A(activin A,ACT-A)属于TGF-β超家族成员,与纤维化形成和细胞凋亡有关,也与心衰的发生、发展过程有关。卵泡抑素(follistatin,FS)是ACT-A的细胞外天然结合蛋白,拮抗ACT-A的生物学作用。然而由于心衰的病因及发病机制十分复杂,ACT-A的作用非常广泛,其在心力衰竭发病过程中的具体机制还不明确。有研究证实急性损伤时ACT-A抑制心肌细胞凋亡,对心肌起保护作用,但本项目组前期研究结果示ACT-A在慢性心衰模型(慢性损伤)中表达升高并加重心室重塑,提示ACT-A的长期表达可能促进心肌细胞凋亡。那么,ACT-A对慢性损伤心肌细胞的作用如何?是否存在表达时限及表达水平的差异性?其在慢性心衰时参与细胞凋亡的机制如何?它与参与心衰发生发展的内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)机制有什么关联?这些是值得我们深入探究的新课题。本研究建立大鼠心梗后心衰模型,利用ELISA方法检测心梗1周、4周及8周大鼠血清ACT-A/FS系统、脑钠肽(brain natriuretic peptide,BNP)和血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ,AngⅡ)的表达水平,并通过免疫组化染色证实心衰后心肌组织中ACT-A/FS系统失衡和ERS的存在,同时应用Western blot方法检测心肌组织中ACT-A/FS系统和ERS相关蛋白的表达水平。为进一步研究ACT-A/FS系统失衡和ERS介导的心肌细胞凋亡是否有关,在细胞实验中,用不同浓度的ACT-A刺激H9c2细胞,利用流式细胞仪和caspase-3活性检测观察ACT-A对心肌细胞凋亡的作用,并选取ACT-A诱导凋亡的最适浓度诱导H9c2细胞细胞凋亡,并分别加入分裂原激活的蛋白激酶p38(p38 mitogen activated protein kinases,p38MAPK)、细胞外信号调节激酶(extracellular regulated protein kinases,ERK)、c-jun N端激酶(c-jun NH2-terminal kinases,JNK)三种信号通路阻断剂和Smad-3阻断剂,用Western blot方法检测FS及ERS相关蛋白的表达,明确ACT-A导致心肌细胞凋亡的机制是否通过ERS实现。为进一步模拟离体情况下心衰时心肌细胞的状态,用AngⅡ刺激H9c2细胞,在培养液中分别加入不同浓度低剂量ACT-A,用Western blot方法检测FS及ERS相关蛋白的表达水平,用流式细胞仪检测细胞凋亡率,研究低浓度ACT-A是否对心肌具有保护作用。本研究得出以下结果:1.心脏大体观察假手术组大鼠心脏体积、几何形状正常,颜色鲜艳,模型组大鼠心脏体积明显增大,梗死区形成室壁瘤凹陷入心室腔内,梗死区心肌明显变薄,梗死区无明显肌组织,纤维化明显,颜色呈广泛的苍白色,局部接近透明。随心梗时间的延长,上述变化更加显著。2.血流动力学指标检测心梗后大鼠左心收缩和舒张功能均明显受损,且随心梗时间延长,心梗8周组LVSP、±dp/dtmax变化更加显著,而LVEDP无明显变化。3.血清Activin A、FS、AngⅡ及BNP水平随着心梗时间的延长,血清ACT-A、BNP、AngⅡ表达越高。FS于心梗4周开始升高(p<0.05),心梗8周后显著升高(p<0.001)。ACT-A/FS比值在心梗1周、4周、8周无明显变化(p>0.05)。4.心肌组织免疫组化染色ACT-A、FS、Caspase-3、CHOP表达免疫组化结果显示假手术组,心肌有低水平ACT-A、FS、CHOP蛋白表达,几乎无Caspase-3蛋白表达;在8周模型组梗死区和非梗死区心肌组织ACT-A、FS、Caspase-3、CHOP表达明显增多。5.左室非梗死区心肌组织蛋白表达水平与假手术组比较,模型组左室非梗死区GRP78、CHOP、BNP、ACT-A于心梗1周开始明显升高(p<0.01,p<0.001,p<0.05,p<0.05),Caspase-3、Caspase-12和FS于心梗4周开始明显升高(p<0.001,p<0.001,p<0.05)。随心梗时间延长,模型组FS表达水平无明显变化。与假手术组相比,随着心梗时间的延长Activin A/FS比值逐渐升高。6.观察不同浓度ACT-A对心肌细胞凋亡的作用,并取诱导凋亡最适浓度用不同浓度(0、6.25、12.5、25、50、100ng/ml)的ACT-A刺激H9c2细胞培养24小时,流式细胞仪检测细胞凋亡率和caspase-3相对活性检测示,100ng/ml浓度的ACT-A可诱导心肌细胞凋亡。7.高浓度ACT-A诱导心肌凋亡并检测ERS相关蛋白及FS表达Western blot结果显示,在单纯ACT-A组CHOP、Caspase-12、GRP-78和FS表达显著升高(p<0.001)。与单纯ACT-A组相比,p38mapk阻断剂+ACT-A组CHOP和GRP-78表达明显下降(p<0.001)。与单纯ACT-A组相比,ERK阻断剂+ACT-A组CHOP、Caspase-12和GRP-78表达明显下降(p<0.001)。与单纯ACT-A组相比,JNK阻断剂+ACT-A组,只有CHOP表达显著下降(p<0.001)。与单纯ACT-A组相比,FS在三个通路阻断剂组表达升高。与单纯ACT-A组相比,在Smad3阻断剂+ACT-A组所有ERS相关蛋白和FS表达均明显下降;与对照组相比,单纯ACT-A组细胞凋亡率明显升高;与单纯ACT-A组相比,三个通路阻断剂组+ACT-A组和Smad3阻断剂+ACT-A组的细胞凋亡率明显下降。8.AngⅡ诱导H9c2细胞凋亡的浓度和时间在用0.01μM,、0.1μM和1μM AngⅡ刺激细胞24、48和72小时后,用MTT方法检测细胞存活率和caspase-3相对活性检测提示,选择0.1μM AngⅡ刺激H9c2细胞24小时。9.低浓度ACT-A对AngⅡ诱导的心肌细胞凋亡的影响及与ERS的关系Western blot结果显示,和对照组比较,AngⅡ0.1μM组ERS相关蛋白表达明显升高。与AngⅡ0.1μM组相比,随着ACT-A浓度升高至50 ng/ml,ERS相关蛋白表达逐渐下降(p<0.001),但FS在ACT-A浓度低于50 ng/ml时表达升高,到ACT-A浓度达到50 ng/ml时FS表达明显下降(p<0.001);随着ACT-A浓度的升高至50 ng/ml,细胞凋亡率逐渐下降。结论:1.心衰时ACT-A/FS系统表达失衡,这种失衡表现为ACT-A先升高、FS后升高;当心衰发展到一定阶段时,机体自身反馈上调FS表达从而拮抗ACT-A作用,使ACT-A/FS系统恢复平衡,从而延缓心衰的进展。2.ACT-A对心肌细胞凋亡的作用与其浓度有关:低浓度(0~50ng/m L)时抑制心肌细胞凋亡,高浓度(100ng/m L)时促进心肌细胞凋亡。3.心衰时ACT-A/FS系统表达失衡,并通过ERS介导的细胞凋亡机制参与心衰的发生发展。