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视神经损伤后如何修复,提高其临床治疗效果,一直是神经科学研究的热点。近年来,外源性α晶状体蛋白在视神经损伤后修复中发挥的作用日益受到人们关注。已有的研究表明,α晶状体蛋白对RGCs的存活和突起生长有显著促进作用,是重要的晶状体源性“神经保护物质”。同时,α晶状体蛋白还可以通过抑制视网膜小胶质细胞的增殖、迁移及活化,降低细胞中TNF-α、iNOS蛋白的浓度及mRNA的表达,减轻其对RGCs的损害。既往文献证实,当细胞受到应激剌激和其它损伤因素作用时,可启动胞内HSPs基因,促使HSPs合成,从而对细胞有一定的保护作用。因此,α晶状体蛋白作为热休克蛋白家族成员,是否参与了视神经损伤后的内源性保护?视网膜神经节细胞是否能表达内源性α晶状体蛋白?倘若视神经损伤后,能使视网膜神经节细胞高表达α晶状体蛋白,是否具有更为理想的神经保护作用?上述问题均未见文献报道。由此,进一步探讨内源性α晶状体蛋白在视网膜神经节细胞中的变化和作用,可能为临床治疗视神经损伤提供新的途径。【目的】通过建立大鼠视神经钳夹伤模型,进一步明确外源性α晶状体蛋白对神经损伤后轴突生长的定量变化;通过离体和在体研究,探讨视网膜神经节细胞中内源性α晶状体蛋白的表达;在此基础上,采用腺病毒介导的基因转染技术,分析α晶状体蛋白高表达对视网膜神经节细胞凋亡的影响。从而阐明α晶状体蛋白在视神经损伤所诱导的神经节细胞凋亡中的作用,并为基因治疗或合成新型的短肽药物治疗视网膜视神经损伤奠定实验基础。【方法】1、以成年Long Evans大鼠为研究对象,建立视神经钳夹损伤模型,玻璃体腔单次注射10-4g/L外源性α晶状体蛋白。通过视神经冠状切片和神经轴突镀银染色方法,利用计算机图象分析系统,分别于损伤后1、2、4周,定量分析和比较视神经损伤远端0.5mm、2mm、5mm处的视神经轴突数量。2、原代培养新生大鼠视网膜神经节细胞,通过免疫荧光染色和激光共聚焦显微镜,观察培养的细胞中内源性α晶状体蛋白的表达,并采用RT-PCR方法检测细胞中内源性α晶状体蛋白mRNA的表达规律。同时,利用成年大鼠视神经钳夹损伤模型和全视网膜铺片的免疫组化方法,观察视神经损伤对视网膜神经节细胞中内源性α晶状体蛋白表达的影响。3、利用同源重组原理,将α晶状体蛋白cDNA克隆入腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV,构建携带α晶状体蛋白编码基因的重组腺病毒表达载体。脂质体法转染293细胞,获得重组腺病毒质粒Ad-Crystallinα。4、将重组腺病毒Ad-crystallinα感染培养的大鼠视网膜神经节细胞,并给予缺氧刺激,通过RT-PCR和werstern blot检测细胞中α晶状体蛋白、caspase-3、bcl-2的表达水平,探讨α晶状体蛋白高表达对缺氧后视网膜神经节细胞凋亡的影响。【结果】1、视神经损伤后,神经轴突数量的改变主要发生在损伤后2周内,并且离损伤点越近,其神经轴突数量减少越明显。通过单次玻璃体腔给药途径,外源性α晶状体蛋白可以显著减少大鼠视神经损伤后神经轴突数量的丢失。但在损伤后4周,α晶状体蛋白的神经保护作用明显减弱。2、用新生大鼠进行视网膜神经节细胞原代培养,培养的RGCs可表达内源性α晶状体蛋白,阳性染色位于RGCs胞膜和轴突。在原代培养第3～5d的RGCs中,内源性α晶状体蛋白mRNA的表达显著增强(P<0.05)。3、正常成年大鼠视网膜神经节细胞内源性α晶状体蛋白表达为阴性。而视神经钳夹伤后的成年大鼠视网膜中可见内源性α晶状体蛋白阳性表达。4、采用RT-PCR方法成功扩增crystallinα目的片段,KpnⅠ和HindⅢ双酶切重组质粒pAdTrack-CMV-crystallinα,蛋白电泳及测序结果显示质粒构建成功,可观察到载体片段和目的基因片段。质粒与腺病毒骨架质粒pAdeasy–1同源重组成功后转染293细胞,进行5次传代纯化后获得重组腺病毒Ad-crystallinα。所获得的腺病毒滴度为1. 143×109 ifu / mL。5、Ad-crystallinα可在培养的大鼠视网膜神经节细胞中高表达。与单纯缺氧组相比,缺氧刺激后Ad-crystallinα转染组细胞中α晶状体蛋白表达量约为单纯缺氧组细胞的1.8倍,统计学差异显著(P<0.05)。6、给予细胞缺氧刺激后,与单纯缺氧组相比,Ad-crystallinα转染组RGCs中caspase-3的蛋白表达水平下降59%,统计学差异非常显著(P<0.01)。【结论】1、α晶状体蛋白在视神经损伤后修复中发挥重要作用。通过玻璃体腔注射途径单次给药,可明显减少受损视神经轴突数量的丢失。2、在离体条件下,原代培养的新生大鼠视网膜神经节细胞有内源性α晶状体蛋白表达。在动物实验中,视神经损伤可以诱发成年大鼠视网膜表达内源性α晶状体蛋白,提示α晶状体蛋白可能参与了视网膜内源性神经保护作用。3、成功构建了高表达α晶状体蛋白的重组腺病毒质粒。4、腺病毒载体介导的α晶状体蛋白可成功转染培养的大鼠视网膜神经节细胞,并高表达α晶状体蛋白。高表达的α晶状体蛋白可显著降低由缺氧诱导的视网膜神经节细胞中caspase-3表达水平,从而减缓RGCs凋亡。