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Ca2+是动植物生长发育过程中主要的营养物质,同时Ca2+信号传递又是细胞中重要的信号转导途径之一,参与和调节着生物体的生长、发育、抗逆等生理反应。胞内Ca2+作为重要的第二信使,控制着许多细胞功能,人们对此研究得已经比较深入。直到1993年,Brown et.al.首次从牛副甲状腺中克隆到了一个G-蛋白耦联的胞外Ca2+敏感受体(CaR),使人们认识到Ca2+在细胞外也发挥着信使的功能。2003年Han and Pei在拟南芥叶片中采用表达克隆的方法克隆到一个胞外Ca2+敏感受体(CAS),能够感受胞外Ca2+浓度的升高,从而引起胞内Ca2+浓度的升高。这个受体的克隆使人们认识到在植物当中Ca2+也可以发挥第一信使的作用。我们利用拟南芥CAS基因序列在GeneBank中比对,发现水稻中存在与之相似性很高的序列,采用同源克隆的策略,在水稻中克隆了OsCAS基因,并对它的序列和功能作了初步的分析和研究。所得序列在GenBank注册,基因号:AY476807。序列分析表明,OsCAS包含1164个碱基对,编码387个氨基酸;在水稻基因组中为单拷贝;计算机软件分析该蛋白具有一个跨膜结构域,在30-50氨基酸处有一段导肽序列。推测OsCAS的C-端位于细胞内,它的作用可能与蛋白质间的相互作用有关,在C端具有一个硫氰酸酶结构域,这个保守区域在磷脂酶和多种蛋白中都有发现,比如在硫氰化酶和一些抗性蛋白中,推测它有可能在一些抗逆反应中具有一定的作用;N-端位于胞外,具有几个酸性氨基酸残基能够结合Ca2+,但没有发现其他保守区域,并且与拟南芥CAS的同源性也较差,可能与胞外Ca2+的结合方式的多样性有关。为研究OsCAS基因的功能,我们做了以下几方面的工作:1.在HEK293细胞系中表达OsCAS。用空载体pcDNA3、水稻OsCAS、拟南芥CAS转化HEK293细胞系。当[Ca2+]o由0.1mM升高到2.5mM时,我们观察到胞内Ca2+信号迅速上升,说明OsCAS具有感受胞外Ca2+浓度升高从而引起胞内Ca2+浓度升高的功能。2.进行OsCAS的细胞学定位。构建UBQ p∷CAS∷eGFP和UBQp∷eGFP转化洋葱表皮细胞,在激光共聚焦显微镜下观察,发现OsCAS定位在质膜上。3.对OsCAS表达部位进行研究。提取水稻不同部位(根、茎、叶)的RNA,逆转录成cDNA,然后进行实时定量PCR反应,结果表明,OsCAS在叶中表达量很高,茎中也有表达,但明显低于叶中的表达量,在根中几乎不表达。4.对OsCAS功能进行研究。构建OsCAS的sense和anti-sense表达载体转化水稻,得到CAS超表达和转基因抑制植株T0代。T0代anti-sense转基因植株在生长发育各个方面与野生型植株相比明显迟缓。对其T1代进行抗逆性研究,发现在OsCAS的表达明显被抑制的情况下,用200mM NaCl处理24小时后,转基因植株表现出对NaCl敏感,转基因植株的叶绿素含量和叶片游离脯氨酸含量明显低于野生型,而且在外加Ca2+的情况下,植物的盐胁迫症状没有明显的改变,而野生型的植株在相同条件下盐胁迫的症状有所缓解。通过对OsCAS基因的序列及功能分析可以得出以下结论:CAS是位于质膜表面的Ca2+受体,能够感受胞外Ca2+浓度的变化,从而引起胞内Ca2+浓度变化。OsCAS基因的表达对水稻的生长发育非常重要,当该基因受到抑制,植株表现出长势弱、抽穗晚,抗逆(盐)性降低。我们分析产生这种现象的原因可能有两个:第一,CAS作为IP3途径的受体,能够引起Ca2+从细胞内钙库释放出来,当它被抑制时,细胞的PLC信号转导途径被破坏,不能引起胞内Ca2+浓度增加,影响了逆境应答基因的表达,而且IP3途径的破坏,使Pro的积累受到影响,而脯氨酸的积累是生物有机体对环境胁迫产生的一种应答反应,能够增强植物的抗逆能力。第二,在高盐条件下Ca2+对于排斥Na+而加强K+的选择性吸收是必要的。总之,当水稻OsCAS的表达受到抑制时,胞内Ca2+信号途径被破坏,从而使植物的耐盐性下降。Ca2+作为植物体信号转导复杂网络中的一个重要组分,往往参与到许多信号途径中,有关以上变化的分子机理还有待于进一步的研究。