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本研究主要分为两大部分,分别是IBS-D肝郁脾虚型病证症结合大鼠模型的建立与评价的初步研究和肠安I号方干预实验性IBS内脏高敏感大鼠的脑肠轴作用机制研究。1 IBS-D肝郁脾虚型病证症结合大鼠模型的建立与评价的初步研究目的:建立一种疾病-证候-症状相结合的IBS-D肝郁脾虚型大鼠模型。方法:(1)模型建立方法:采用新生母子分离+慢性束缚+番泻叶灌胃法复制IBS-D肝郁脾虚型病证症结合大鼠模型。(2)模型评价方法:以结直肠扩张的疼痛阈值代表内脏高敏感性,评价”疾病”模型的建立;以旷场实验和血清D-木糖水平评价肝郁脾虚”证型”的建立;以排便粒数和稀便率评价腹泻”症状”的建立。结果:(1)造模结束时,不同组间大鼠的体重变化存在统计学差异(F=10.132,p=0.000<0.05),与正常组比较,三因素组大鼠的体重增长量较少,存在统计学差异p<0.05)。(2)造模结束后,各组大鼠的疼痛阈值存在统计学差异(F=41.299,p=0.000<0.05),三因素组大鼠疼痛阈值明显降低,与正常组相比存在统计学差异(p<0.05)。(3)束缚结束后,各组大鼠总穿格数、站立次数、修饰次数存在统计学差异(p<0.05),与正常组相比,三因素组大鼠总穿格数、站立次数、修饰次数明显减少(p<0.05)。(4)各组大鼠血清D-木糖含量存在统计学差异(F=143.614,p=0.000<0.05),与正常组相比,三因素组大鼠血清D-木糖含量均显著下降(p<0.05)。(5)造模结束时,三因素组大鼠排便粒数与正常大鼠存在统计学差异(p<0.05)。结论:应用SD大鼠进行新生母子分离+慢性束缚+番泻叶灌胃的复合造模,造模结束时三因素组大鼠体重增长速度减缓,结直肠扩张时疼痛阈值降低,内脏敏感性增高;旷场实验穿格数、站立次数及修饰次数均明显降低;血清D-木糖含量明显降低,小肠吸收功能下降;排便粒数及稀便率均明显升高,而结肠黏膜组织HE染色未见明显异常,符合IBS-D肝郁脾虚型疾病特点,可能是一种较好的研究中医药治疗IBS疗效机制的动物模型,但仍需要进一步的深入研究。2肠安I号干预实验性IBS内脏高敏感大鼠的脑肠轴作用机制研究目的:研究肠安Ⅰ号方对IBS内脏高敏感模型大鼠的作用机理,验证肠安Ⅰ号方改善IBS内脏高敏感性是基于脑和肠的双重作用的假设。实验一、肠安Ⅰ号对IBS模型大鼠体重及内脏敏感性的影响方法:(1)模型的建立与评价:采用慢性束缚应激结合游泳致疲劳法复制IBS内脏高敏感大鼠,以体重变化、内脏敏感性评价和病理组织学作为模型评价指标。(2)肠安Ⅰ号的干预作用:采用体重变化量评估体重的变化;大鼠结直肠扩张时大鼠腹壁回撤反射表现出3级反应时的压力阈值为疼痛阈值,以疼痛阈值评估大鼠内脏敏感性的变化。结果:(1)造模结束时,不同组间大鼠的体重变化存在统计学差异(F=3.551,p=0.000<0.05),与正常组相比,模型组(p=0.019)大鼠的体重增长量明显减少;组间大鼠的疼痛阈值存在统计学差异(F=8.311,p=0.000<0.05),与正常组相比,模型组大鼠疼痛阈值明显下降(p<0.05);各组大鼠结肠病理组织HE染色各组均未见明显改变。(2)灌药4、8、12天及治疗结束时,不同组间大鼠的体重变化均无统计学差异(p=0.730,0.804,0.137,0.444)。用药结束后,各组大鼠直肠扩张时的疼痛阈值存在统计学差异(x 2=30.933,p=0.000<0.05);与正常组大鼠相比,模型组大鼠疼痛阈值明显降低(x 2=24.8472;p=0.0000<0.05);与模型组相比,氟西汀组、肠安Ⅰ号高、中、低剂量组大鼠疼痛和阈值明显升高(x 2=8.7969,13.9562,12.7508,13.8110;p=0.0123,0.0009,0.0017,0.0010<0.05)。实验二、肠安Ⅰ号对IBS模型大鼠结肠5-HT的影响方法:采用结肠免疫组织化学染色法结合结肠粘膜积分光密度、积分光密度组织比的半定量分析评价大鼠结肠5-HT水平。结果:用药结束后,各组大鼠结肠5-HT水平存在统计学差异(χ2=53.144,p=0.000<0.05)。与正常组大鼠相比,模型组大鼠结肠5-HT水平明显升高(x 2=38.2112;p=0.0000<0.05)。与模型组相比,得舒特组、肠安Ⅰ号高、中剂量组结肠5-HT水平显著下降(x 2=13.9439,14.6154,15.8966;p=0.0009,0.0004,0.0007<0.05)。实验三、肠安Ⅰ号对IBS模型大鼠血清5-HT的影响方法:采用酶联免疫吸附法测定大鼠血清5-HT水平。结果:用药结束后,各组大鼠血清5-HT水平存在统计学差异(x 2=53.125,p=0.000<0.05)。与正常组大鼠相比,模型组大鼠血清5-HT水平升高(x 2=34.4853;p=0.0000<0.05)。与模型组相比,得舒特组、肠安Ⅰ号高、中剂量组大鼠血清5-HT水平显著下降(x 2=19.6384,16.0064,16.6231;p=0.0001,0.0003,0.0002<0.05)。实验四、肠安Ⅰ号对IBS模型大鼠海马5-HT1a、BDNF基因表达的影响方法:采用荧光定量实时PCR方法检测大鼠海马5-HT1a、BDNF mRNA基因表达水平。结果:(1)用药结束后,各组大鼠海马5-HTla mRNA相对表达量存在统计学差异(x 2=59.606,p=0.000<0.05)。与正常组大鼠相比,模型组大鼠海马5-HT1a mRNA表达水平升高(x 2=40.5840;p=0.0000<0.05)。与模型组相比,肠安Ⅰ号高、中、低剂量组大鼠海马组织5-HT1a mRNA表达水平显著下降(x 2=11.6823,25.7737,14.5150;p=0.0029,0.0000,0.0007<0.05)。(2)用药结束后,各组大鼠海马BDNF mRNA的相对表达量存在统计学差异(x 2=45.914,p=0.000<0.05)。与正常组大鼠相比,模型组大鼠海马BDNF mRNA表达水平升高(x 2=36.7966;p=0.0000<0.05)。与模型组相比,氟西汀组、肠安Ⅰ号高、中、低剂量组大鼠海马BDNF mRNA表达水平升高下降(x 2=17.2327,10.9142,10.2546,13.6571;p=0.0002,0.0043,0.0059,0.0011<0.05)。实验五、IBS模型大鼠内脏敏感性与结肠黏膜5-HT水平的相关性研究目的:观察大鼠内脏敏感性与结肠黏膜5-HT水平的相关关系。方法:相关性分析采用线性相关分析的方法,若数据符合双变量正态分布,使用Pearson相关系数r;若不符合,采用Spearman相关系数rs。p<0.05为差异有统计学意义。结果:对所有大鼠的分析发现,疼痛阈值与结肠黏膜5-HT水平呈线性负相关关系(rs=-0.435,p=0.000),内脏敏感性与结肠5-HT水平呈正相关关系。实验六、IBS模型大鼠内脏敏感性与血清5-HT水平的相关性研究目的:观察大鼠内脏敏感性与血清5-HT水平的相关关系。结果:对所有大鼠的分析发现,疼痛阈值与血清5-HT水平呈线性负相关关系(rs=-0.484,p=0.000),内脏敏感性与血清5-HT水平呈正相关关系。实验七、IBS模型大鼠内脏敏感性与海马BDNF mRNA基因表达水平的相关性研究目的:观察大鼠内脏敏感性与海马BDNF mRNA基因表达水平的相关关系。结果:对所有大鼠的分析发现,疼痛阈值与海马BDNF mRNA基因表达水平呈线性负相关关系(rs=-0.550,p=0.000),内脏敏感性与海马BDNF mRNA基因表达水平呈正相关关系。实验八、IBS模型大鼠内脏敏感性与海马5-HT1a mRNA基因表达水平的相关性研究目的:观察大鼠内脏敏感性与海马5-HT1a mRNA基因表达水平的相关关系。结果:对所有大鼠、模型组及用药组大鼠的分析发现,疼痛阈值与海马5-HT1a mRNA基因表达水平呈线性负相关关系(rs=-0.629,-0.773,-0.324,p=0.000,0.015,0.030),内脏敏感性与海马5-HT1a mRNA基因表达水平呈正相关关系。结论:肠安I号的作用靶点部位涉及”脑-肠”两部分,可下调血清及结肠黏膜5-HT水平,下调海马组织中BDNF和5-HT1amRNA的表达;大鼠内脏敏感性的改变与血清及结肠黏膜5-HT水平、海马BDNF和5-HT1a呈线性相关关系,内脏敏感性的下调是以血清及结肠黏膜5-HT水平、海马BDNF和5-HT1a水平的下调为内在机制的,至于其相互间的复杂作用关系可能需要进一步的深入研究。